Высокочувствительные модульные тест-системы для экспрессного контроля остаточных количеств антибиотиков в мясной продукции

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 24-16-00273

НазваниеВысокочувствительные модульные тест-системы для экспрессного контроля остаточных количеств антибиотиков в мясной продукции

Руководитель Жердев Анатолий Виталиевич, Доктор химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" , г Москва

Конкурс №92 - Конкурс 2024 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки; 06-301 - Технология пищевых продуктов

Ключевые слова Безопасность продуктов питания, мясные продукты, антибиотики, реакция антиген-антитело, иммунодетекция, иммунохроматография, внелабораторное тестирование, проточные системы, нанодисперсные маркеры, модульное комплексообразование

Код ГРНТИ68.01.81

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Исследования последних лет подтверждают высокую степень актуальности мониторинга остаточных количеств антибиотиков в пищевых продуктах животного происхождения, обусловленную как непосредственными токсическими эффектами, так и ростом распространенности антибиотико-резистентных штаммов патогенных микроорганизмов. При этом основной тенденцией развития нормативной базы в последние годы является значительное расширение перечня контролируемых антимикробных средств. Так, в настоящее время ТР ТС «О безопасности мясной продукции» устанавливает максимально допустимые уровни для 51 соединения и групп соединений, а в июле 2024 г. предусмотрено расширение этого перечня до 78 соединений и групп соединений и контроль как сырья, так и переработанной продукции. В этой связи в рамках действующей двухуровневой системы контроля востребовано методическое перевооружение, включающее возможность оперативного скринингового тестирования по всему перечню контролируемых соединений. Проект направлен на решение этих задач посредством расширения возможностей иммунохроматографических тест-систем – эффективного средства быстрого и производительного контроля, осуществляемого за пределами специализированных лабораторий. В рамках проекта применительно к антибиотикам разных классов будут реализованы подходы, обеспечивающие оперативную адаптацию к выбираемым для контроля соединениям и воспроизводимую оценку содержания контаминант с минимизацией влияния матрикса тестируемых проб на детектируемый сигнал. Новый комплекс разрабатываемых и характеризуемых методик будет объединять: - предложенный заявителями модульный принцип комплектации тест-системы с объединением универсальной тест-полоски, содержащей общие реагенты для контроля разных антибиотиков и подбираемые с учетом конкретной решаемой задачи растворы селективных иммунореагентов; - нанодисперсные маркеры (металлические и полиметаллические частицы с развитой поверхностью, флуоресцентные наночастицы), выявляемые в существенно меньших количествах по сравнению с традиционным иммунохроматографическим маркером – коллоидным золотом; - средства быстрой экстракции и концентрирования, обеспечивающее включение во взаимодействие в порах тест-полоски молекул целевых аналитов из существенного (около двух порядков) большего объема исходных проб. Работы консорциума исполнителей из ФИЦ Биотехнологии РАН и ФИЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова РАН обеспечат детальную характеристику возможностей использования разрабатываемых тестов применительно к разным видам сырья и готовой мясной продукции с учетом разных видов технологических обработок, формирование репрезентативных выборок для адаптации тест-систем, сопоставление получаемых результатов с данными арбитражного хроматографического контроля, метрологическую оценку результатов, получаемых при использовании портативных регистраторов для измерения связывания детектируемых маркеров. План проекта предполагает как выявление требований к наиболее эффективным реагентам и общих закономерностей взаимодействий в высокочувствительных модульных тест-системах, применимым для иммунохроматографической детекции различных практически значимых соединений, так и разработку экспериментальных серий тест-систем как основы для масштабируемых технологий их производства.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Проект направлен на разработку новых иммунохроматографических тест-систем для оперативного скринингового тестирования антибиотиков разных классов в пищевых продуктах животного происхождения, перечень которых в нормативных документах существенно расширился в последние годы. Для обеспечения оперативной адаптации тестов к выбираемым для контроля соединениям предусмотрен модульный принцип комплектации тест-системы, объединяющей универсальную тест-полоску, содержащую общие реагенты для контроля разных антибиотиков, и подбираемые с учетом конкретной решаемой задачи растворы селективных иммунореагентов. Проведенные в 2024 году работы были направлены на формирование панели иммунореагентов, нанодисперсных маркеров, конъюгатов на их основе и разработку методических решений для высокочувствительных систем детекции различных антибиотиков. Выбраны высокоаффинные комбинации иммунореагентов для детекции антибиотиков разных классов на основании данных их сопоставления методами поверхностного плазмонного резонанса и иммуноферментного анализа. Получены и охарактеризованы конъюгаты нанодисперсных носителей (синтезированные препараты наночастиц золота (НЧЗ) и наноцветов золота, коммерческий препарат карбоксилированных квантовых точек Qdot™ 585) с наиболее аффинными иммунореагентами. Наночастицы и конъюгаты на их основе охарактеризованы по размерам и форме методами просвечивающей электронной микроскопии и динамического рассеяния света, по аффинности связывания с соответствующими антигенами - методами биосенсорного анализа с регистрацией поверхностного плазмонного резонанса и ИФА, по реакционной способности в мембранных системах - методом иммунохроматографического анализа (ИХА). Результатом работ стало формирование панели конъюгатов антител и нанодисперсных маркеров разного состава для использования в разрабатываемых иммунохроматографических тест-системах для детекции антибиотиков. Изготовлена и охарактеризована панель матричных образцов мясного сырья с регламентируемым шагом контаминирующих аналитов (антибиотиков групп пенициллинов, тетрациклинов, хлорамфеникола, стрептомицина и их структурных аналогов, а также бацитрацина) для оценки достоверности и точности результатов тестирования с использованием разрабатываемых тест-систем. Проведена характеристика влияния матрикса биопроб и технологического воздействия низких и высоких температур (замораживание при –18 °С, нагрев до +72 °С – в центре пробы) на концентрацию остатков антибиотиков методом ВЭЖХ/МС-МС. Разработаны две иммунохроматографические тест-системы для детекции тилозина - с использованием прямой (специфические антитела, конъюгированные с НЧЗ) и непрямой (свободные специфические антитела и антивидовые антитела, конъюгированные с НЧЗ) маркировки антител. Использование непрямого формата ИХА позволило снизить предел обнаружения в 7 раз. Показано, что разработанная схема ИХА позволяет определять 92-113% тилозина в образцах мясного сырья. Разработан ИХА тетрациклина с использованием собственной пероксидазоподобной активности золотых наночастиц. Схема непрямого усиленного ИХА с использованием конъюгата антивидовых антител с НЧЗ и субстрата пероксидазы характеризовалась инструментальным пределом обнаружения 0.03 нг/мл, что в 7.6 раза ниже, чем для анализв без усиления. Предложенный и успешно апробированный непрямой анализ тетрациклина с каталитической стадией позволил повысить чувствительность без использования новых меток или дорогостоящих методик детекции сигнала, а только за счет трехминутной инкубации тест-полоски с пероксидазным субстратом.

Публикации

1. Жердев А.В. Immunochromatographic detection of antibiotics: Nanoparticles-based tools to overcome the existing limitations Abstract book of the 15th International Conference «Biomaterials and Bionanomaterials: Recent Advances Safety-Toxicology and Ecology Issues», c. 19 (год публикации - 2024)
10.18332/pht/191647

2. Баршевская Л.В., Сотников Д.В., Зверева Е.А., Дзантиев Б.Б., Жердев А.В. Comparative characteristics of immunochromatographic test systems for tylosin antibiotic in meat products Sensors, T. 24, article 6865 (год публикации - 2024)
10.3390/s24216865

3. Жердев А.В., Зверева Е.А., Таранова Н.А., Сафенкова И.В., Вострикова Н.Л., Дзантиев Б.Б. Immunochromatographic food control tools: new developments and practical prospects Theory and practice of meat processing, Т. 9, № 4, c. 280-295 (год публикации - 2024)
10.21323/2414-438X-2024-9-4-280-295

4. Жердев А.В., Сафенкова И.В., Дзантиев Б.Б. Мембранные тесты: расширение возможностей иммунохимической и молекулярно-генетической диагностики и контроля для внелабораторного применения Материалы Всероссийской конференции с международным участием "Биохимия человека", с. 11 (год публикации - 2024)

5. Жердев А.В., Зверева Е.А., Гендриксон О.Д., Асламова А.А., Панферов В.Г., Дзантиев Б.Б. Применение нанозимов в иммунохроматографических тест-системах обнаружения антибиотиков АСТАНА БИОТЕХ 2024: Материалы Международной конференции «Астана Биотех 2024» (Eurasian Journal of Applied Biotechnology), № 3S, с. 122 (год публикации - 2024)
10.11134/btp.3S.2024.110

6. Зверева Е.А., Баршевская Л.В., Гендриксон О.Д., Сотников Д.В., Дзантиев Б.Б., Жердев А.В. Universal modulal immunochromatographic platform for monitoring antibiotic residues in foods with simple adoption to different analytes Abstact book of XXII European Conference on Analytical Chemistry EuroAnalysis , c. 689 (год публикации - 2025)

7. Жердев А.В., Зверева Е.А., Гендриксон О.Д., Панферов В.Г., Дзантиев Б.Б. Metallic nanozymes of different compositions for sensitive lateral flow immunoassays for antibiotics in meat products Program and Abstract Book of The 5th International Electronic Conference on Biosensors, P. 97 (год публикации - 2025)

8. Зверева Е.А., Гендриксон О.Д., Дзантиев Б.Б., Жердев А.В. Enhanced immunochromatographic assay of tetracycline using intrinsic peroxidase‑like activity of gold nanoparticles Analytical and Bioanalytical Chemistry , V. 417, p. 5105-5114 (год публикации - 2025)
10.1007/s00216-025-06032-6

9. Вострикова Н.Л., Хвостов Д.В., Утьянов Д.А., Захарова В.А., Булгаков Р.П., Жердев А.В. Methods of detecting the veterinary drugs residues and the ways of reducing their content in food products. Review Theory and practice of meat processing, V. 10, no. 2, p. 109-119 (год публикации - 2025)
10.21323/2414-438X-2025-10-2-109-119

10. Зверева Е.А., Баршевская Л.В., Гендриксон О.Д., Дзантиев Б.Б., Жерадев А.В. Immunochromatographic tests for rapid monitoring of antibiotic residues in meat products Book of Abstracts of 10th International Congress on Biomaterials and Biosensors BIOMATSEN, 2025, P. 31 (год публикации - 2025)

11. Жердев А.В., Зверева Е.А., Сотников Д.В., Панферов В.Г., Дзантиев Б.Б. Комплексы наночастица–белок как биоаналитические реагенты: Выбор способов получения и оценка функциональных характеристик продуктов Сборник тезисов II Научной конференции «Искусственный интеллект в химии и материаловедении», С. 88 (год публикации - 2025)

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Проведенные в 2025 году работы были направлены на выбор универсальных реагентов для разработки модульных систем детекции антибиотиков, в том числе тест-систем с разными вариантами амплификации сигнала. Исследования позволили разработать модульный принцип комплектации тест-систем для иммунохроматографического анализа (ИХА) с объединением универсальной тест-полоски, содержащей общие реагенты для контроля разных антибиотиков, и применяемых с учетом конкретной задачи растворов селективных иммунореагентов. Данный подход упрощает технологию изготовления тест-систем и позволяет легко адаптировать их применение к конкретным решаемым задачам. Модульная схема основана на взаимодействии стрептавидина, иммобилизованного в тестовой зоне, и биотинилированного конъюгата определяемого антибиотика с белком-носителем. Конкуренция биотинилированного конъюгата и присутствующего в пробе антибиотика за центры связывания специфических антител определяет наличие/отсутствие и степень связывания иммунного комплекса в тестовой зоне. Визуализация образующихся специфических комплексов обеспечивается использованием конъюгата антивидовых антител с наночастицами золота (НЧЗ). Предложенный подход реализован для определения антибиотиков различных классов – тетрациклина, линкомицина и тилозина, которые широко используются в животноводстве. Проведен выбор конструкции и состава мембранного комплекса модульной тест-системы, состава, концентрации, расположения иммунореагентов, а также последовательности и продолжительности стадий анализа. Критериями выбора были четкость визуального обнаружения и высокая чувствительность анализа. Установлены оптимальные концентрации реагентов в составе универсальной тест-системы. Тест-система позволила детектировать тилозин, тетрациклин и линкомицин с визуальными и инструментальными пределами обнаружения 8.3 / 0.06 нг/мл, 5.5 / 0.2 нг/мл, 17.7 / 1.7 нг/мл соответственно. Разработаны методики для повышения чувствительности иммунохроматографического определения антибиотиков разных классов в модульных системах. Оптимизация схемы, основанной на пероксидазоподобных свойствах НЧЗ, показала, что введение стадии усиления с использованием субстратной смеси на основе 3,3′,5,5′-тетраметилбензидина привело к незначительному увеличению интенсивности окрашивания тестовой зоны. Замена конъюгата НЧЗ с антивидовыми антителами на конъюгат квантовые точки - белок G существенно увеличило диапазон изменений отклика системы, что позволило уменьшить концентрацию специфических антител, следствием чего стало снижение предела обнаружения ИХА. По сравнению с ИХА на основе НЧЗ удалось достичь снижения предела обнаружения в 33 раза. Подготовлены модельные образцы на основе фарша из куриной грудки с регламентируемым шагом контаминирующих аналитов (пенициллин, тетрациклин, хлорамфеникол, стрептамицин). Определение внесенной контаминации (введено-найдено) проводили с помощью разработанных тест-систем и методом ВЭЖХ-МС/МС. В качестве технологических воздействий высоких температур рассматривали разные по продолжительности и температурному воздействию режимы обработки модельных образцов: варка, запекание, жарка с маслом и без масла. Показано, что все изученные антибиотики подвержены деградации при тепловой обработке. Эффективность разрушения зависит от температуры и продолжительности термического воздействия. Наименее устойчивы хлорамфеникол и пенициллин, тогда как стрептомицин продемонстрировал наиболее высокую устойчивость к тепловому воздействию. Изучение спектра образующихся токсичных продуктов (альдегидов и аминов) при термической обработке контаминированных антибиотиками модельных образцов показало, что продолжительное тепловое воздействие усугубляет катализируемое антибиотиками окисление жирных кислот. Если говорить о способе термической обработки, предпочтительной для здоровья человека, то степень риска уменьшается в ряду жарка (масло) > жарка (без масла) > запекание > варка. Показано, что антибиотики оказывают модулирующее действие на процесс образования гетероциклических ароматических аминов, которое зависит от типа антибиотика и способа приготовления пищевой продукции. Негативный эффект усиливался с ростом времени обработки. Сформированная панель проб, получаемых в унифицированных воспроизводимых условиях, позволяет проводить доказательную сравнительную оценку различных разрабатываемых методик и тест-систем, а также коммерческой аналитической продукции, что определяет ее высокую востребованность, выходящую за рамки исследований по проекту.

Публикации