Аннотация результатов, полученных в 2024 году
• Были формализованы имеющиеся литературные данные о фотофизических реакциях, возникающих при взаимодействии фотонов с автофлуоресцирующими молекулами NADH, участвующими в цепи окислительно-восстановительных реакций в митохондриях. Была разработана схема реакций, учитывающая наиболее вероятные изменения состояния молекулы NADH при взаимодействии с внешним излучением и окружающей биохимической средой: данная схема позволила выявить наличие петли обратной связи в цикле переходов NADH/NAD под действием внешнего излучения. Для анализа описанных в схеме процессов может использоваться величина флуоресценции NADH (fNADH). • Ключевые реакции в полученной схеме (фотообесцвечивание NADH, формирование пула NADHp, необратимые потери NADH, релаксация с образованием NAD+ и H+, работа фермента GDH по восстановлению равновесия NADH/NAD) были описаны динамически в виде дифференциальных уравнений, которые можно объединить в общую систему уравнений с добавлением уравнения баланса. Введенные физические величины были обоснованы и согласованы между различными уравнениями системы. • Для полученной системы дифференциальных уравнений найдено устойчивое численное решение. Решение такой системы было получено с использованием методов Рунге-Кутта (явный метод 4-го порядка и неявный 1-го порядка), вычислительная схема реализована при помощи языка Python с библиотекой SciPy. Пример вычислительного кода представлен по ссылке: https://colab.research.google.com/drive/13HtkUHVFOZj1zHIF9RUbQWW5GzlSR3ws?usp=sharing. • Проведён анализ полученных решений. Показана возможность точной аппроксимации экспериментальных кривых фотообесцвечивания модельными данными. Для достижения точной аппроксимации необходимо варьирование начальных условий, при которых инициировалось фотообесцвечивание NADH. Выбраны параметры, имеющие наибольшее влияние на форму кривой фотообесцвечивания: локальный поток поглощаемого возбуждающего излучения (Eex), коэффициент активности фермента GDH (Vmax) и начальная концентрация молекул NADH. Последние два параметра являются ключевыми для описания метаболического состояния исследуемой ткани и могут быть найдены при помощи аппроксимации. Показано, что каждый из трёх параметров влияет на форму кривой фотообесцвечивания различным образом, данный результат проверен при помощи анализа экспериментальных данных. Сочетание таких качеств позволяет говорить о наличии однозначного соответствия между формой кривой фотообесцвечивания и начальным состоянием митохондрий (концентрация NADH и активность GDH), характеризующим степень ишемии/гипоксии исследуемой ткани. • Начата работа по эффективному решению «обратной» задачи: поиску параметров Eex, Vmax и начальной концентрации молекул NADH. Проведена пробная аппроксимация множества кривых фотообесцвечивания, снятых с оптически неоднородной поверхности сердечной ткани. Показано, что варьирование параметров модели позволяет достаточно точно аппроксимировать различные кривые фотообесцвечивания, получив для каждой из них значения Eex, Vmax, [NADH]0. Полученные карты (распределения) значений Eex, Vmax, [NADH]0 были проверены на наличие корреляций: показано отсутствие корреляции у значений Eex и Vmax, полученных аппроксимацией, что подтверждает корректность модели и всего подхода в целом (поскольку эти значения по физическому смыслу действительно должны быть независимыми). • Полученная модель дополнительно валидирована за счёт аппроксимации многоступенчатого фотообесцвечивания: значение Vmax, полученное при помощи аппроксимации позволяет предсказать скорость восстановления NADH в промежутках между повторяющимися циклами фотообесцвечивания в протоколе ED-FRAP.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В ходе второго года выполнения проекта был успешно реализован и экспериментально подтверждён новый оптический метод для бесконтактной и безреференсной оценки метаболического состояния сердечной ткани в реальном времени. Метод основан на интерпретации сигнала фотообесцвечивания молекул никотинамидадениндинуклеотида в восстановленной форме (НАДН). НАДН – ключевой элемент дыхательной цепи клеток и является одним из известнейших соединений, обладающих автофлуоресцецнией в живых тканях. И флуоресценция, и фотолиз молекул НАДН обеспечиваются возбуждающим излучением одной длины волны (ближний ультрафиолет). Ключевым достижением данного этапа стало завершение полной проверки гипотезы об однозначном соответствии между динамикой спада флуоресценции НАДН во время фотообесцвечивания и ключевыми метаболическими параметрами. Нами было найдено аналитическое решение системы дифференциальных уравнений, описывающих конкуренцию между фотолизом НАДН до НАД+ и его ферментативным восстановлением с помощью фермента глутаматдегидрогеназы (ГДГ). Данный результат позволил по записи флуоресценции НАДН с сердечной ткани получить визуализировать область ткани с недостаточным снабением кислорода – в том числе карты мгновенной обратимой ишемии (рост концентрации НАДН, сдвиг соотношения НАД+/НАДН и при ишемии) и необратимой ишемии (замедление процессов восстановления). Ключевой момент заключается в том, что впервые была показана прямая связь замедления процессов восстановления (ГДГ) с последующей дисфункцией сердечной ткани. Для практического применения модели была разработана высокоэффективная вычислительная платформа. Для обработки больших массивов видеоданных (512×512 пикселей) создана многоуровневая схема с «наследованием» начальных приближений между блоками разного размера и использованием графического процессора. Это позволило сократить время построения детальных метаболических карт («карт ишемии») с нескольких часов до менее одной минуты. Дополнительно была обучена свёрточная нейронная сеть, которая позволяет получать карты ишемии без доступа к мощным графическим процессорам. Экспериментальная валидация проведена на трёх типах биологических объектов: монослоях кардиомиоцитов человека, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (9 биологических повторностей), изолированных перфузируемых сердцах крысы (6 образцов) и культурах кардиальных фибробластов. Разработан комплекс алгоритмов предобработки, обеспечивающих сохранение формы кинетической кривой: 1) SUPPORT — свёрточная сеть для образец-специфичного подавления шума в монослоях; 2) Алгоритм оптического потока (библиотека Optimap) для стабилизации изображений бьющегося сердца; 3) Фильтр Ланцоша для кластеризации сигналов. Этот комплекс обеспечил корректный анализ данных в условиях артефактов движения и высокого уровня шума. Полученные научные результаты: Впервые продемонстрирован прогностический потенциал анализа ГДГ: показана сильная корреляция между падением активности ГДГ во время острого метаболического стресса (4 часа) и замедлением скорости проведения возбуждения в ткани через неделю после повреждения. На изолированных сердцах в условиях ишемии обнаружены и описаны «метаболические пятна» — локальные зоны с аномально низкой активностью ГДГ, невидимые при стандартной НАДН-визуализации. Их появление и исчезновение после реперфузии подтверждает, что метод выявляет ранние обратимые и последующие необратимые изменения метаболизма. Практическая значимость метода доказана в серии экспериментов с варьированием мощности излучения и концентрации НАДН. Метод устойчив к изменяющимся условиям эксперимента и позволяет автоматически детектировать артефакты, связанные с неоднородностью освещения или геометрии образца. Таким образом, разработанный метод преодолевает фундаментальные ограничения классической интенсивностной визуализации НАДН. Он позволяет за 10 секунд измерения получать количественные метаболические карты всей поверхности сердца, что в 10 раз быстрее традиционного ED-FRAP, и не требует референсных измерений. Результаты открывают перспективы для создания систем оперативной оценки жизнеспособности донорских сердец и мониторинга метаболизма в реальном времени. Информационные ресурсы по проекту: Открытая база данных с аннотированными экспериментальными записями и примерами кода для построения карт: https://doi.org/10.5281/zenodo.15802786 и https://colab.research.google.com/drive/1RtxRmhndjbWZurUIHTTYpGj0Yc-B3HWW?usp=sharing Открытый препринт с детальным описанием метода и алгоритмов: https://www.researchsquare.com/article/rs-7159262/v1