Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В ходе первого года реализации проекта мы провели полное фенотипическое описание трех чистых культур глубоких линий филума Bacteroidota, выделенных из горячих источников Северной Осетии: двух представителей нового рода Rosettibacter (cемейство Melioribacteraceae, класс Ignavibacteria) и нового вида рода Tenuifilum (cемейство Tenuifilaceae, класс Bacteroidia). Было показано, что по физиологии данные организмы принадлежат группе умеренно термофильных нейтрофильных бактерий. По метаболизму все три штамма оказались хемоорганогетеротрофами, растущими как на белковых субстратах (желатин, казеин, пептон и др.), так и на простых сахарах и полисахаридах (ксилан, крахмал, лихенан, пахиман, пуллулан и др) с образованием водорода, ацетата и углекислоты. Помимо брожения данные бактерии были способны к дыханию: Rosettibacter primus и R. firmus использовали для дыхания серу, тиосульфат, арсенат, цитрат железа, ферригидрит и кислород (т.е. являлись факультативно анаэробными организмами), а ‘Tenuifilum osseticum’ использовал для дыхания только серу и не рос в аэробных либо микроаэробных условиях, являясь таким образом строгим анаэробом. Были проведены стандартные хемотаксономические анализы (состав жирных кислот и хинонов), результаты которых дополнили диагностические признаки исследуемых родов. Полные геномы трех штаммов были отсеквенированы, проаннотированы и проанализированы. Было показано, что представители рода Rosettibacter обладают впечатляющим (более 170) набором генов, кодирующих ферменты гидролиза полисахаридов (гликозидазы, полисахаридлиазы, углеводэстеразы), в отличие от ‘T. osseticum’, для которого удалось обнаружить только 30 генов гликозидаз. Кроме того, в геномах были проанализированы гены ЭТЦ, кодирующие ферменты для аэробного и анаэробного дыхания. Полученные данные хорошо соотносятся с ростовыми экспериментами. Параллельно с описанием трех штаммов, используя различные микробиологические подходы, из высокообогащенных накопительных культур, полученных ранее при посеве образцов из осетинских гидротерм нами были выделены еще две чистые культуры представителей филума Bacteroidota. Предварительный филогенетический анализ показал, что культура 4129-to представляет новый род внутри семейства Prolixibacteraceae, а культура 4136-str может быть описана как представитель нового семейства “Tepiditomixaceae” внутри порядка Bacteroidales (группа известная ранее как SB-5). Все перечисленные культуры были задепонированы в международных коллекциях, что позволит в дальнейшем валидно опубликовать их имена. Была проведена экспедиция в район горячих источников республики Северная Осетия-Алания. Отобрано 12 проб осадков, илов, матов, обрастаний и воды из различных по физико-химическим параметрам гидротерм. Из фиксированных образцов в лабораторных условиях были выделены препараты ДНК, которые мы использовали для анализа состава микробных сообществ, используя современные молекулярные методы - высокопроизводительное секвенирование участка V3V4 гена 16S рРНК, а также кПЦР со специфическими праймерами. Праймеры были разработаны для амплификации целевых групп филума Bacteroidota – представителей семейств Melioribacteraceae и Tenuifilaceae – и протестированы на имеющихся коллекционных штаммах. В результате удалось показать значительное разнообразие представителей Bacteroidota, обитающих в горячих источниках Осетии, в том числе глубоких некультивируемых линий (IheB3-7, PHOS-HE36 и др.). Было показано также, присутствие в источниках представителей выделенных нами ранее видов Rosettibacter, Tenuifilum, “Tepiditomix”, что свидетельствует об устойчивости микробных сообществ в данных гидротермах. В ряде случаев доля целевых организмов составляла до 10%, что демонстрирует их важную роль в функционировании микробных сообществ.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В ходе второго года реализации проекта было проведено полное фенотипическое описание пяти чистых культур глубоких линий филума Bacteroidota, выделенных из горячих источников Северной Осетии-Алании: двух представителей нового семейства “Tepiditomixaceae” (класс Bacteroidia), представителя нового рода “Tepiditalea” (cемейство Prolixibacteraceae, класс Bacteroidia) и двух представителей нового вида рода Melioribacter (cемейство Melioribacteraceae, класс Ignavibacteria). Было показано, что по физиологии все описанные организмы принадлежат группе умеренно термофильных нейтрофильных бактерий, за исключением “Tepiditalea inopinata”, которая была термотолерантным алкалофилом. По метаболизму все пять штаммов являлись хемоорганогетеротрофами, способными сбраживать простые сахара и полисахариды (ксилан, крахмал, целлюлоза, камеди и др.) с образованием водорода, углекислоты, ацетата и в ряде случаев лактата. Белковые соединения также использовались выделенными штаммами, за исключением представителей cемейства ‘Tepiditomixaceae’, что существенно отличает их и от всех ближайших организмов родственных семейств. Помимо брожения новые представители рода Melioribacter были способны к аэробному и анаэробному дыханию с соединениями азота, железа и мышьяка, а также с использованием элементной серы и тиосульфата, что впервые показано для данного рода. Бактерии семейства ‘Tepiditomixaceae’ также использовали серу и тиосульфат, но в процессе "облегченного брожения". Были проведены стандартные хемотаксономические анализы (состав жирных кислот и хинонов), результаты которых дополнили диагностические признаки исследуемых родов. Все перечисленные культуры были задепонированы в российских и международных коллекциях, что позволит валидно опубликовать их имена. Полные геномы всех штаммов были отсеквенированы, проаннотированы и проанализированы. Было показано наличие генов, кодирующих ферменты гидролиза полисахаридов и белков, генов ЭТЦ для бактерий, способных к различным типам дыхания, а также генов путей синтеза основных продуктов брожения. Полученные данные хорошо соотносятся с ростовыми экспериментами. Наличие полных геномов позволило провести анализ занимаемого исследуемыми организмами филогенетического положения на основе конкатенированных аминокислотных последовательностей 120 бактериальных консервативных маркерных генов. Параллельно с описанием чистых культур, полученных на первом этапе, были поставлены накопительные культуры из свежих проб, отобранных из горячих источников Северной Осетии-Алании в 2024 году. Используя различные микробиологические и молекулярные подходы, помимо упомянутых выше новых представителей рода Melioribacter и семейства “Tepiditomixaceae”, на данном этапе был выделен новый представитель рода Tenuifilum. По морфологии и физиологии он был похож на ближайший родственный организм - ‘Tenuifilum osseticum’, описание которого было опубликовано нами в этом году, однако данные филогенетического анализа показали, что этот изолят представляет новый вид в роде. Для детекции представителей семейства SB-5 были разработаны высокоспецифичные праймеры. Праймеры были протестированы на препарате ДНК из единственного на тот момент культивируемого представителя данного семейства (“Tepiditomix exilis” штамм 4136-str) и успешно использованы для детекции целевых бактерий в полученных ранее препаратах ДНК, выделенных из термальных источников Северной Осетии-Алании. Использование разработанных систем праймеров позволило оценить количественное содержание представителей группы SB-5 в микробных сообществах исследуемых горячих источников и способствовало выделению в чистую культуру второго представителя данного семейства - "Tepiditomix superfactus". Было проведено метагеномное секвенирование природных образцов, из которых выделены чистые культуры новых представителей Bacteroidota. Показано, что количественная оценка содержания исследуемых целевых групп в анализируемых микробных сообществах, полученная с использованием трех молекулярных подходов (кПЦР со специфическими праймерами, профилирование по региону V3V4 гена 16S рРНК и метагеномное секвенирование), дает схожие результаты, а значит позволяет избежать использования дорогостоящих методов анализа в будущем. Экологическая роль, выполняемая представителями исследуемых в рамках данного проекта глубоких линий филума Bacteroidota (семейства Melioribacteraceae, Tenuifilaceae и нового семейства “Tepiditomixaceae”), по всей видимости, различается в микробных сообществах горячих источников Северной Осетии-Алании. В подавляющем большинстве они являются минорными компонентами (менее 1% от общей численности), а значит выполняют роль вторичных деструкторов органического вещества. Тем не менее, в ряде случаев их доля составляет до 10%, что может свидетельствовать в пользу выполнения ими функции первичных деструкторов и важной роли в поддержании стабильности таких микробных сообществ. Полученные на данном этапе результаты были освещены на международной конференции в Минске (https://mbio.bas-net.by/2025) и в различных СМИ (https://ria.ru/20250227/nauka-2001723390.html, https://rscf.ru/news/release/uchenye-opisali-novyy-vid-bakteriy-iz-goryachego-istochnika-severnoy-osetii/?sphrase_id=1330135, https://www.fbras.ru/uchenyie-opisali-novyiy-vid-bakteriy-iz-goryachego-istochnika-severnoy-osetii.html).