Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Был проведён поиск последовательностей кандидатных поли(А)-полимераз (PAP) бактерий. Для дальнейшей работы выбрали кандидатные PAP из бактерий Hydrogenobacter thermophilus, Marinobacter lipolyticus, Klebsiella pneumonia, Enterococcus faecalis, Thermocrinis albus, Geobacillus stearothermophilus, Proteus mirabilis, Bacillus subtilis, Thermus thermophilus, Pseudomonas putida. Выбранные кодирующие последовательности кандидатных PAP синтезировали искусственно (Hydrogenobacter thermophilus и Marinobacter lipolyticus) или амплифицировали с использованием геномных ДНК соответствующих бактерий и клонировали в вектор pET23b. Всего было получено 7 плазмидных конструкций, названных по бактерии-хозяину: pPAP-Eco, pPAP-Hth, pPAP-Mli, pPAP-Kpn, pPAP-Efa, pPAP-Gst, pPAP-Pmi. Пробная наработка рекомбинантных кандидатных PAP в 4 штаммах E. coli: BL21 (DE3) pLysS, Rosetta Blue (DE3), SoluBL21 (DE3), Shuffle T7 с использованием ИПТГ показала, что PAP Kpn и Gst не нарабатываются в таких условиях, в то время как PAP Efa, Pmi, Mli были успешно наработаны. Возможной причиной тому могла являться повышенная токсичность рекомбинантных PAP для клеток E. coli, которая ранее была показана для аналогичного фермента E. coli. При автоиндукции по Стадиеру в штаммах BL21 (DE3) pLysS, Rosetta Blue (DE3), BL21 Gen-X (DE3), Shuffle T7 продукции PAP Kpn также не наблюдалось, PcnB Gst была получена в Shuffle T7, BL21 (DE3) pLysS, BL21 Gen-X (DE3). После наработки PAP Efa и Pmi были нерастворимы вне зависимости от штамма, времени и температуры индукции. Совместная наработка шаперонов GroEL-GroES и Tig в штамме Shuffle T7 не позволила получить растворимую PAP Mli. Присоединение белка CusF, увеличивающего растворимость химерных белков, к N-концу PAP Efa также не позволило получить растворимую PAP Efa. PAP Hth была получена в растворимом состоянии. Для проверки поли(А)-полимеразной активности были получены препараты отмытых телец включения с кандидатными PAP Efa, Mli, Pmi, Eco. В препаратах PAP Efa и Pmi поли(А)-полимеразная активность не была обнаружена во всех опробованных условиях. В препаратах PAP Mli, Eco, Gst была выявлена поли(А)-полимеразная активность и для PAP Mli, Eco была предварительно определена эффективность полиаденилирования в зависимости от состава реакционного буфера. PAP Eco наиболее эффективно элонгировала субстрат при рН 9,0 в присутствии NaCl и KCl, PAP Mli — при рН 7,0 и 200 мМ NaCl и KCl. Полученные данные носят предварительный характер и нуждаются в проверке с использованием очищенных ферментов. Было установлено, что PAP Eco более эффективно полиаденилирует субстрат в присутствии марганца, чем магния. PAP Hth была очищена с помощью металл-хелатной и ионообменной хроматографий до не менее, чем 90% чистоты. Однако поли(А)-полимеразная активность в препарате PAP Hth выявлена не была. Возможными причинами агрегации и потери ферментативной активности при лизисе могут быть неоптимальный состав реакционного буфера или принципиально иная специфическая активность PAP Hth, что требует дальнейшей проверки. Очистка PAP Mli в разных условиях лизиса с помощью металл-хелатной хроматографии на сорбенте, заряженном ионами разных металлов, была неуспешной. Целевой белок выпадал в осадок во время процедур выделения или терял ферментативную активность. Таким образом, были найдены 6 кандидатных бактериальных поли(А)-полимераз из бактерий, относящихся к Gammaproteobacteria, Aquificota, Alphaproteobacteria, Bacilli. Кодирующие последовательности этих белков были клонированы в вектор pET23a для наработки рекомбинантных белков в клетках E. coli и подобраны условия для наработки кандидатных PAP Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis, Hydrogenobacter thermophilus, Marinobacter lipolyticus, Geobacillus stearothermophilus. Проверка наличия ферментативной активности у рекомбинантных ферментов, находившихся в тельцах включения, выявила таковую только у PAP Marinobacter lipolyticus и Geobacillus stearothermophilus. Кроме того, была очищена кандидатная PAP Hydrogenobacter thermophilus, однако поли(А)-полимеразной активности у этого белка не было отмечено. Параллельно оптимизировали условия наработки рекомбинантной PAP E. coli, этого определяя количество, растворимость и специфическую активность PAP-1 E. coli, наработанной в 7 различных штаммах E. coli: BL21 (DE3) pLysS, BL21 Gen-X (DE3), Lemo21 (DE3), SoluBL21 (DE3), Shuffle T7, Rosetta 2 (DE3), Rosetta Blue (DE3). Из использованных штаммов BL21 Gen-X (DE3) и SoluBL21 (DE3) достигли наименьшей оптической плотности, что коррелирует с их более медленным ростом, заявленным производителем. Наибольшее количество PAP-1 наблюдалось в Shuffle T7 и BL21 (DE3) pLysS, наименьшее — в BL21 Gen-X и SoluBL21 (0,18–0,24%). При этом количество PAP-1 не коррелировало с оптической плотностью культур и температурой инкубации. Растворимость PAP-1 уменьшалась при увеличении температуры инкубации. В Rosetta 2 (DE3) и Rosetta Blue (DE3) PAP-1 почти полностью находилась в нерастворимой фракции при всех температурах инкубации. Возможным объяснением низкой растворимости PAP-1 в штаммах Rosetta может служить слишком высокая скорость трансляции, обусловленная повышенным уровнем редких тРНК, закодированных в плазмиде pRARE. Растворимостью PAP-1 слабо коррелировала с уровнем её активности, между специфической активностью и температурой инкубации корреляции отмечено не было. Таким образом, PAP-1 в некоторой степени сохраняла ферментативную активность в нерастворимом состоянии либо выходила из телец включения во время анализа активности. Оценка количества геномной ДНК и плазмиды, кодирующей PAP-1 E. coli, с помощью количественной ПЦР в режиме реального времени показала, что в отличие от плазмиды, количество геномной ДНК не коррелировало с ростом температуры инкубации. Негативная корреляция наблюдалась между растворимостью PAP-1 и копийностью плазмиды. Количество PAP-1 позитивно коррелировало с копийностью плазмиды, что может служить суррогатным маркером накопления рекомбинантной PAP-1 в клетках E. coli. Таким образом, оптимальный баланс между количеством, растворимостью и ферментативной активностью рекомбинантной PAP-1 E. coli был достигнут при наработке этого белка в клетках E. coli штамма BL21 (DE3) pLysS. Полученные данные могут стать важным источником информации при оптимизации условий получения PAP-1 E. coli, ценность которого для биотехнологии значительно выросла в последние годы в связи с развитием технологии мРНК-вакцин. Копийность плазмиды, кодирующей PAP-1, может потенциально стать суррогатным маркером накопления рекомбинантной PAP-1. По результатам работы подготовлена статья «Optimization of conditions for production of soluble E. coli polyA-polymerase», находящаяся на реценции в рецензируемом издании «Biology», индексируемом в базах данных Scopus, Web of Science и РИНЦ. Текст статьи выложен в открытый доступ в репозитории bioRxiv: DOI: 10.1101/2024.12.01.626206.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Клонированы PAP-1 E. coli и кандидатная поли(А)-полимеразы Bacillus subtilis в векторы для экспрессии в E. coli pET21a, pET36b, тРНК нуклеотидилтрансфераза (ССА-трансфераза) E. coli в вектор pET28a и кандидатная PAP G. stearothermophilus в векторы pBADM41 и pET28a. Всего было получено 7 плазмидных конструкций: pET28a-Eco, pET28a-Eco, pET28a-Bsu, pET28a-Gst, pBADM41-Gst, pET28a-EcoCCA. Пробная наработка ССА-трансферазы E. coli в 5 штаммах E. coli: BL21 (DE3) pLysS, T7 Express, Rosetta Blue (DE3), SoluBL21 (DE3), Shuffle T7. BL21 (DE3) pLysS при 18, 25 или 37 °С в питательной среде LB-Miller и использованием ИПТГ была неуспешной, возможно, из-за токсичности этого фермента. Удалось наработать Gst PAP, клонированную в pET28aM. PAP-1 E. coli и кандидатные Mli PAP, Efa PAP, Bsu PAP, Gst PAP, Pmi PAP наработали в 4 л питательной среде LB-Miller при 37°С в E. coli BL21 (DE3) pLysS. PAP-1 E. coli, Bsu PAP, Gst PAP очищены с помощью металл-хелатной хроматографии и ионообменной хроматографии до не менее, чем 90% электрофоретической чистоты. Закончена оценка пригодности белка CusF для повышения растворимости рекомбинатных белков. Как и CusF-Efa PAP, химерный белок CusF-mCherry был почти полностью нерастворим после наработки E. coli штаммов BL21 (DE3) pLysS и Rosetta 2 (DE3) с помощью ИПТГ при 25 и 37°С. CusF-mCherry не связывался с сорбентом IMAC, заряженным ионами Cu(II). Полученные данные могут стать важным источником информации при работе с CusF и другими подобными белками, т.к. отсутствие опубликованных негативных результатов препятствует оценке их эффективности и не позволяет выбрать их оптимальный набор. По результатам работы подготовлена статья «Insights into the performance of CusF as a solubility tag for recombinant protein expression», находящаяся на рецензии в издании «IJMS», индексируемом в базах данных Scopus, Web of Science и РИНЦ. Текст статьи выложен в открытый доступ в репозитории bioRxiv: DOI: 10.64898/2025.12.08.693106. Проведён подбор условий для растворения кандидатных Mli PAP, Efa PAP, Pmi PAP из телец включения. Отмытые тельца включения ресуспендировали в буферах с рН 4,5–10,5 и NaCl (1–2 M), KCl (1–2 M), (NH4)2SO4 (0,5–1 М), 2М мочевиной, 0,5 М L-аргинином, 0,5 М сахарозой. Во всех опробованных условиях Efa PAP и Pmi PAP оставались в нерастворимом состоянии. Менее 25% Mli PAP переходило в растворимую фракцию в буфере с 2 М NaCl, но растворённая Mli PAP не связывалась ни с одним использованным сорбентом при рН 7–9: Macro-Prep HighQ, Macro-Prep HighS, Heparin SepFast Media, Macro-Prep t-Butyl HIC и IMAC, заряженном ионами Ni(II), Co(II), Fe(II), Cu(II), Ca(II), Zn(II). По этой причине оценку активности Mli PAP проводили, используя отмытые тельца включения, которые растворяли в буфере, содержащем 2 М NaCl. Наличие CCA-трансферазной активности у кандидатных PAP Efa и Pmi оценили, используя in vitro транскрибированную радиоактивно меченную глициновую тРНК E. coli, варьируя рН (7,0–9,0), соли (NaCl, KCl, NH4Cl, (NHS4)2SO4) и их концентрацию (25-200 мМ) при 37°С. ССА-трансферазная активность не была обнаружена у PAP Efa и Pmi во всех опробованных условиях. Предварительно определили оптимальные условия для полиаденилирования с помощью кандидатных PAP B. subtilis и G. stearothermophilus, варьируя рН (7,0–9,0), соли (NaCl, KCl, NH4Cl, (NHS4)2SO4) и их концентрацию (25-200 мМ). Активность PAP детектировали по элонгации олиго(р)А20 субстрата, меченного на 5′-конце FAM при 37 и 50°С. Bsu PAP проявила поли(А)-полимеразную активность в более широком диапазоне условий, чем Gst PAP. Bsu PAP и Gst PAP агрегировали в течение нескольких дней при хранении при +4°С, агрегация замедлялась в присутствии 2,5 мМ ДТТ или 5 мМ бета-меркаптоэтанола. Сравнили биохимические свойства Mli PAP и PAP-1 E. coli. Активность PAP оценивали по элонгации олиго(р)А20 субстрата, меченного на 5′-конце FAM, варьируя температуру инкубации, рН и соли в реакционном буфере. Оптимальная температура для обоих ферментов была в диапазоне 30–35°С. Mli PAP и PAP-1 E. coli теряли активность после инкубации при температуре 50°C и выше, однако стабилизировались субстратом без добавления АТФ. Оптимальным кофактором для обеих PAP являлся 10 мМ Mg(II), специфическая активность в присутствии ионов Co(II) и Mn(II) была ниже. Оптимальным рН был 8,0–9,0, а оптимальная соль — 100 мМ NaCl и KCl для PAP-1 E. coli и 150 мМ KCl. Обе PAP ингибировались солями аммония. Определили специфичность Mli PAP и PAP-1 E. coli к нуклеотидам, титруя нуклеотид трифосфаты в оптимальном реакционном буфере для каждого фермента. Значения Km(АТФ) составили 1,70 и 1,61 мМ для Mli PAP и PAP-1 E. coli соответственно. Обе PAP были способны элонгировать субстрат в присутствии ЦТФ и УТФ, но не ГТФ, эффективность элонгации субстрата в присутствии ЦТФ и УТФ была значительно ниже, чем в присутствии АТФ. Таким образом, охарактеризованы биохимические свойства первой поли(А)-полимеразы из Alfaproteobacteria, проведено сравнение этого фермента с E. coli PAP-1. По результатам работы подготовлена статья «The first poly(A) polymerase from Alphaproteobacteria», находящаяся на рецензии в издании «IJMS», индексируемом в базах данных Scopus, Web of Science и РИНЦ. Текст статьи выложен в открытый доступ в репозитории bioRxiv: DOI: 10.64898/2025.12.04.692054. Подводя итог, в течение второго года выполнения проекта были получены 3 новые бактериальные поли(А)-полимеразы из Marinobacter lipolyticus, Bacillus subtilis и Geobacillus stearothermophilus. Mli PAP была частично очищена из телец включения, Bsu PAP и Gst PAP были очищены до 90% электрофоретической чистоты. Биохимические свойства Mli PAP были сравнены с ранее описанной PAP-1 E. coli, были предварительно оценены оптимальные условия для полиаденилирования с помощью Bsu PAP и Gst PAP. Не обнаружены поли(А)-полимеразная и ССА-трансферазная активности в тельцах включения с кандидатными PAP из E. faecalis и P. mirabilis. Оценена эффективность металл-связывающего белка E. coli CusF для повышения растворимости кандидатной Efa Pap и флуоресцентного белка mCherry. Подготовлены и отправлены две статьи в издание «IJMS», индексируемое в базах данных Scopus, Web of Science и РИНЦ, находящиеся в настоящий момент на рецензии, их исходные варианты выложены на ресурсе bioRxiv.org (10.64898/2025.12.04.692054 и 10.64898/2025.12.08.693106). Кроме того, подготовлена заявка на выдачу свидетельства на объект интеллектуальной собственности — способ получения PAP-1 E. coli. Результаты оптимизации наработки PAP-1 E. coli были упомянуты в СМИ в том числе в новостях РАН (https://new.ras.ru/activities/news/otkryt-novyy-sposob-polucheniya-fermenta-dlya-razrabotki-rnk-vaktsin/), Науке в Сибири (https://www.sbras.info/news/sibirskie-uchenye-uprostili-vyrabotku-fermenta-neobkhodimogo-dlya-razrabotki-rnk-vakcin).