Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Основной задачей на этот год было понять, какие метаболические регуляторы являются ключевыми для переключения образа жизни бактерий от свободноживущего к биопленкам. Были сравнены транскриптомы свободноживущих клеток E. coli K-12 MG1655 и клеток, находящихся в составе биопленок. Оказалось, что спектр генов, экспрессия которых менялась при переходе к биопленкам, практически не зависел от источника углерода, но при этом экспрессия генов ферментов углеводного метаболизма существенно изменялась. Отдельно стоит отметить активацию генов, кодирующих ферменты и транспортеры метаболизма гексуронатов – гена тагатуронат редуктазы uxaB и гексуронатного транспортера exuT. Это подтверждает важную роль метаболизма гексуронатов в процессе образования биопленок, что было показано нами и ранее (Бессонова и др. Микробиология, 2024). Среди генов со значительно повышенной экспрессией в клетках биоплёнок были также гены, кодирующие транскрипционные регуляторы, в том числе, известные регуляторы образования биоплёнок, и гены малых РНК - сигнальной 4.5S РНК (ffs) и малой регуляторной 6S РНК (ssrS). SsrS была существенно суперэкспрессирована, поэтому она была использована в качестве одного из четырех генов для оценки экспрессии при выборе отдельных клонов для дальнейшего секвенирования транскриптомов и поиска факторов, приводящих к формированию биопленок и соответствующей дисперсии в данных. Впервые был проведен эксперимент по одновременной оценке формирования биопленок и экспрессии ключевых генов в отдельных клонах E. coli. С помощью ОТ-ПЦР в реальном времени было впервые показано сильное ингибирование экспрессии малой РНК CsrC при удалении гена регуляторного белка YjjM (LgoR). Наряду с активацией fliA, указывает на роль YjjM в регуляции подвижности бактерий и формирования ими биопленок. При удалении гена cAMP-CRP, который ранее был предсказан как один из регуляторов процесса формирование биопленок, наблюдалась небольшая активация csgD, что, в целом, согласуется с полученными нами ранее данными (Бессонова и др, Микробиология, 2024), но на малые РНК он не влиял, и, в целом, эффекты были не такими яркими, как в случае делеции yjjM. Это было полностью подтверждено и физиологическими тестами. Влияние YjjM на гены подвижности и биопленок было подтверждено в транскриптомном анализе. При удалении yjjM были существенно активированы гены подвижности – flgB, кодирующий один из четырех белков, составляющих основу тела флагеллы; flhB, кодирующий белок биосинтеза флагелл, и ген флагеллярного белка FliL. Были также активированы гены основного белка хемотаксиса CheA и сигма фактора подвижности FliA, хотя они не вошли в 50 наиболее активируемых генов. Напротив, гены, отвечающие за формирование биопленок, фимбрий и пилей curly (fimA, csrA, bhsA, bssS, bssR, ycgZ), были ингибированы. Были также сильно ингибированы гены малых РНК CsrB-CsrC, что подтверждает ключевую роль YjjM в формировании биопленок, а присутствие SsrS в его регулоне свидетельствует в пользу участия SsrS в регуляции этого процесса. В отсутствие yjjM были также существенно ингибированы гены РНК-шаперона Hfq и глобального регулятора cAMP-CRP. Это говорит о том, что YjjM может влиять и на малые РНК, в том числе за счет Hfq, а показанное ранее влияние CRP на формирование биопленок может быть опосредованным. Было подтверждено, что транскрипция гена fliA в ΔuxuR нестабильна - мы наблюдали “взрывную” экспрессию fliA, но, как и в (Bessonova et al, IJMS, 2022), только в одной лунке. В трансляционном мутанте ΔuxuR-tr дисперсия снижается, и можно наблюдать репрессию fliA за счет антисмысловых РНК гена uxuR. В присутствии РНК, синтезируемых из гена uxuR, также пропадает “плавающая” активация CsrC. В целом, из этого эксперимента и последующего транскриптомного анализа клонов следует, что удаление гена uxuR приводит к разбалансировке экспрессии всех генов, отвечающих за формирование биопленок, а малые РНК помогают стабилизировать этот процесс. С помощью pull-down с последующей LC/MS спектрометрией впервые были найдены белковые партнеры РНК, синтезируемых с гена uxuR. Во всех протестированных условиях с ними были связаны белки метаболизма гексуронатов и шаперон транспорта пре-белков SecB. SecB – это основной шаперон пути секреции Sec, поддерживающий вновь синтезированные секреторные белки в несвернутом состоянии для транслокации, и его связывание с малыми РНК может говорить об участии в их секреции из клетки. Таким образом, установлено, что формирование биопленок сопровождается значительной перестройкой клеточного метаболизма, в которой важное место занимает метаболизм гексуронатов. Ключевую роль в переключении образа жизни E.coli играют малые некодирующие РНК и регулятор метаболизма гексуронатов YjjM, в том числе, за счет влияния на экспрессию РНК. Подготовлено две статьи, которые были приняты в печать: 1. Дахновец А.И., Бессонова Т.А., Озолинь О.Н., Тутукина М.Н. “Поиск белков, сорбирующихся на малые РНК гена uxuR в Escherichia coli K-12.”// Сорбционные и хроматографические процессы, 2024, выпуск 6 (Scopus, RSCI, “Белый список”) 2. Казнадзей А.Д., Дахновец А.И., Бессонова Т.А., Тутукина М.Н. “Анализ транскриптомов свободноживущих Escherichia coli K-12 MG1655 и клеток в составе биопленок” // Математическая биология и биоинформатика, 2024, выпуск 2 том 19. (Scopus, RSCI, “Белый список”) Полученные результаты были доложены на трех международных конференциях: 1) Бессонова Т.А. стендовый доклад “Search for the transcription factors involved in the regulation of biofilm formation in Escherichia coli K-12”// “Биоинформатика регуляции и структуры геномов/системная биология” (BGRS/SB 2024), 5-10 августа 2024, Новосибирск (тезисы https://doi.org/doi 10.18699/bgrs2024-1.2-09) 2) Тутукина М.Н. устный доклад “Стохастические процессы в переключении жизни бактерий” // “Генетика и биоэнергетика клетки - основа современной медицины и биотехнологии”, памяти профессора В.Н. Попова, 17-18 сентября 2024, ВГУ, Воронеж 3) Тутукина М.Н. приглашенный доклад “Антисмысловая транскрипция у бактерий: почему и зачем?”// “Геномика, метагеномика и молекулярная биология микроорганизмов” (III GMMMC), 23-24 октября 2024, Сколтех, Москва 23 мая в Сколтехе была проведена экскурсия в рамках акции “Наука без Турникетов”, где мы также рассказали слушателям о своих исследованиях.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
С помощью глубокого секвенирования было показано, что при росте на компонентах пектина, D-глюкуронате и D-галактуронате, штамм дикого типа E. coli K-12 MG1655 секретирует большее количество экзоРНК в среду по сравнению с ростом на глюкозе, тогда как в штамме с удаленным геном регуляторного белка YjjM при росте на D-глюкуронате экзоРНК практически не детектировались. У клеток, находящихся в составе биопленок количество экзоРНК в целом ниже, чем у клеток, растущих в стандартных лабораторных условиях, но при росте на D-галактуронате оно оставалось высоким в обоих штаммах и во всех условиях роста. Это подтверждает как необходимость галактуроната для успешной колонизации и формирования биопленок, так и, по-видимому, сигнальную функцию секретируемых РНК. Разнонаправленное действие гексуронатов на процесс формирования биопленок было подтверждено и с помощью экспрессионного анализа. Было впервые исследовано влияние гексуроновых кислот на экспрессию генов, продукты которых играют ключевые роли в регуляции адгезии E. coli к поверхности и формировании биопленки. С помощью обратной транскрипции с последующей количественной ПЦР было показано, что D-галактуронат и D-глюкуронат действуют не одинаково. D-галактуронат активирует экспрессию гена регулятора формирования биопленок csgD и шаперона фимбрий 1 типа fimC в 1.5-3 раза и более, чем в 10 раз индуцирует экспрессию малой РНК SsrS в биопленках, что потенциально усиливает способность E. coli K-12 MG1655 к колонизации поверхностей. При этом на интенсивность образования биопленки D-галактуронат оказывал слабое ингибирующее влияние. D-глюкуронат в клетках в составе биопленки, напротив, в 2.5-3 раза подавляет экспрессию csgD и fimC, а также гена структурного белка жгутика flgK. В соответствии с этим, в присутствии D-глюкуроната интенсивность образования биопленок существенно снижена. Таким образом, было подтверждено его ингибирующее действие. Впервые было показано, что малая 6S РНК SsrS активирует образование биопленок, а суперпродукция малой РНК CsrC активирует этот процесс даже при росте на D-глюкуронате. Полученные нами данные позволяют предположить, что малые РНК SsrS и CsrC играют важную роль в переключении клетки к формированию биопленок, а гексуронаты могут быть использованы в качестве модулирующих агентов, в том числе, в клинической практике. С помощью эксперимента pull-down с последующей LC/MS спектрометрией были надежно определены белки-партнеры факторов транскрипции UxuR и YjjM. Было подтверждено, что UxuR способен связываться (вероятно, формируя гетеродимеры) со своим паралогом ExuR, а также с Uid-белками - бета-глюкуронидазой UIdA и фактором транскрипции UidR. Для YjjM были обнаружены контакты с регулятором MhpR, который контролирует деградацию пропионатов, и белком LRP, который является нуклеоид-ассоциированным и контролирует экспрессию около 10% генома кишечной палочки, включая гены формирования биопленок и подвижности. Во многих патогенных штаммах он является регулятором вирулентности. Этот результат объясняет полученный нами в 2017 году ChIP-seq - при росте культуры на глюкозе YjjM имел сайты связывания, похожие на сайты нуклеоидного белка, вблизи регуляторных областей генов, отвечающих за вирулентность. На глюкуронате же мишени YjjM были типичными для метаболического регулятора, и это тоже подтверждается связыванием с ним UxaC и UxuB. С помощью анализа транскриптомов отдельных клонов одних и тех же штаммов, формирующих биопленки с разной эффективностью, было впервые показано, что в штамме дикого типа K-12 MG1655 наибольшая вариабельность экспрессии и максимальная корреляция с интенсивностью образования биопленок характерна не для флагеллярных генов, а для регулятора EcpR/MatA, контролирующего экспрессию фимбрий, в одном экспрессионном кластере с которым находились гены, связанные с сигнализацией c-di-GMP. В делеционном мутанте ΔuxuR наблюдалась наиболее сильная стохастичность в формировании биопленки, связанная в основном с шумящей экспрессией fli- и flg-генов, повторяющая все наши предыдущие эксперименты. Присутствие малых РНК сглаживало дисперсию, что подтверждает их регуляторную роль. В Δcrp яркий эффект был получен для pgaA, который кодирует синтез основного компонента биопленок. Он был дерепрессирован,и его экспрессия строго коррелировала с количеством биопленок. Этот результат подтверждает влияние CRP через “регуляцию регуляторов”. Несмотря на технические трудности, возникшие в процессе выполнения проекта, все поставленные задачи были выполнены - был существенно сужен круг поиска ключевых регуляторов формирования биопленок. Была подтверждена важнейшая роль найденных регуляторных РНК и фактора транскрипции YjjM, на работе с которым, в том числе, в клинических изолятах E. coli мы планируем сосредоточиться в дальнейшем. Подготовлено две статьи, одна из которых была принята в печать, а вторая подготовлена в виде препринте: 1. Бессонова Т.А., Кузнецова У.Д., Магкаев А.Т., Гельфанд М.С., Тутукина М.Н. “Влияние гексуроновых кислот на экспрессию генов структурных белков жгутиков и регуляторов формирования биопленок у Escherichia coli K-12 MG1655.”// Молекулярная биология, 2026, №4, том 60 (Scopus, RSCI, “Белый список”) 2. Anna Kaznadzey, Tatiana Bessonova, Uliana Kuznetsova, Mikhail Gelfand, Maria Tutukina “Stochastic motility-adhesion switch within the E. coli K-12 strains revealed by gene expression clustering” // biorxiv, 2025 Полученные результаты были доложены на пяти конференциях, включая устные доклады на 12-я Московской конференции по вычислительной молекулярной биологии, 5-м Российском микробиологическом конгрессе и научно-практической конференции “Генетика-2025” Подготовлен черновой текст патента на оптический датчик, позволяющий измерять оптическую плотность формирующих биопленки культур в морбидостате.