Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В ходе выполнения проекта «Ультраструктурная организация и метаболические сети перспективного для биотехнологии протиста Thraustochytrium aureum ssp. strugatskii» в 2024 году получены следующие результаты. 1. Мы оценили влияние условий культивирования на динамику роста и состав культуры Thraustochytrium aureum spp. strugatskii. Культивирование в среде YT на основе дрожжевого экстракта и триптона, предпочтительнее, чем в среде FAND на основе FBS. 1) Число ядер увеличивается как 2^N вместе с увеличением размера клеток. В среде FAND мы наблюдали клетки на стадиях кариокинеза с 1, 2, 4, 8, 16, 32 и 64 ядрами без промежуточных значений В среде YT появились также клетки с ~128 и ~256 ядрами. 2) Кариокинез происходит синхронно. 3) Ядра преимущественно располагаются по периферии клетки начиная со стадии кариокинеза 16 ядер. 2. Проведено детальное ультраструктурное исследование и сравнительный электронно-микроскопический анализ структурной организации Thraustochytrium aureum ssp. strugatskii на стадиях вегетативной клетки, зооспорангия и свободной зооспоры. Для каждой стадии проведён морфометрический анализ клеток и клеточных органелл. Вегетативные клетки представляют собой округлые клетки, размер которых варьирует в диапазоне от 2 до 6 мкм. Ядро округлой формы располагается в центре. Цитоплазма плотная, содержит многочисленные рибосомы и основные клеточные органеллы. Митохондрии имеют трубчатые кристы и локализуются в разных участках цитоплазмы. Комплекс Гольджи представляет собой плотно уложенные стопки цистерн. Клетки содержат липидные капли, с разной интенсивностью окраски осмием, не окрашенные осмием участки и мембранные включения. На стадии зооспорангия для клеток характерен наибольший размер среди исследуемых групп: от 5 до 10 мкм. Как и на вегетативной стадии, в клетке присутствуют основные клеточные органеллы, липидные капли и лизосомы. Зооспоры представляют собой вытянутые клетки, размер клеток варьирует от 2,5 до 3 мкм. Свободно плавающие зооспоры содержат ядра, единый митохондрион с трубчатыми кристами, комплекса Гольджи, выглядящий аналогично предыдущим стадиям, парануклеарное тело, расположенное рядом с ядром, липидные капли и вакуоли. Интересной особенностью является наличие тяжей шероховатого эндоплазматического ретикулума, которые присутствуют практически в каждой зооспоре и формируют магистральные элементы, лежащие параллельно ядерной мембране. 3. Изучена структура зооспорангия и зооспоры на световом уровне, оценено распределение F-актина после посадки зооспор на субстрат и образования эктоплазматической сети. Показано, что зооспоры располагаются преимущественно по периферии, как и большинство ядер в клетках с числом ядер превышающем восемь. Часто в центре наблюдался фрагмент остаточной цитоплазмы, не содержащий ядер. При окраске клеток в культуре красителем Phalloidin (окраска F-актина) в начале образования эктоплазматической сети наблюдается полярное распределение сигнала, что свидетельствует о локальной концентрации актиновых филаментов вблизи одного из полюсов клетки в момент образования ботросомы. 4. Проведена реконструкция метаболических путей для семейства траустохитрид и апланохитрид на основе массового анализа геномных и транскриптомных данных. Для одиннадцати видов протистов были определены основные метаболические пути и ферментативные компоненты. К настоящему моменту времени остается открытым вопрос того, насколько разнообразны траустохитриды по своим метаболическим свойствам. В нашей выборке из 11 видов траустохитрид, существенный вклад в количество детектированных ферментативных компонент у них вносит фактор качества данных, что отражается на их кластеризации в главных компонентах. Нехватка протеомных данных хорошего качества, является критической для точной оценки наличия определенных ферментативных компонент у конкретных видов траустохитрид. Таким образом, основным лимитирующим фактором для уточнения особенностей метаболизма траустохитрид является малое количество и ограниченное качество доступных омиксных данных. В частности, особенно ценной стратегией, могут стать подходу количественной и структурной протеомики для открытия новых ферментов у траустохитрид, а также интерактомные данные для установления взаимодействий между транскрипционными факторами и основными ферментами биосинтеза ключевых метаболитов.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В ходе выполнения проекта «Ультраструктурная организация и метаболические сети перспективного для биотехнологии протиста Thraustochytrium aureum ssp. strugatskii» в 2025 году получены следующие результаты. 1. В рамках проекта разработана агент-ориентированная модель лабораторной культуры морского протиста T. aureum ssp. strugatskii, предназначенная для воспроизведения роста многоядерных клеток, синхронного деления их ядер и перехода к образованию зооспор в контролируемых условиях, с учётом варьирования питательной среды. Модель учитывает тип среды, наличие глюкозы и степень разбавления, а также пространственное поведение прикрепляющихся клеток, формирующих многослойные скопления в зависимости от плотности соседей. Выходными величинами служат динамика численности клеток, распределение числа ядер, средний размер клеток, концентрации субстратов и оптическая плотность с учетом вклада многослойных скоплений. Архитектура программы включает планировщик и сборщик данных для агентов-клеток, а также модель среды. С помощью разработанной модели показано, как индивидуальные правила роста и деления порождают популяционную динамику, для которой параметры роста сопоставимы с экспериментальными кривыми оптической плотности. Создание модели лабораторной культуры позволяет интегрировать биологические знания и вычислительное моделирование, обеспечивая: (i) планирование экспериментов in vitro с учетом ожидаемых динамик роста, (ii) проверку гипотез о механизмах деления и расселения спор. В дальнейшем модель может быть расширена для учёта диффузии, температуры и pH, конкуренции между агентами. 2. Проведена трёхмерная реконструкция органелл T. aureum ssp. strugatskii на стадиях зооспоры и многоядерной вегетативной клетки. Анализ изображений трехмерной реконструкции стадии многоядерных клеток выявил разветвленную сеть парануклеарного тела и митохондрий. Ассоциированные с ядром парануклеарные тела способны формировать единую сеть, которая может локализоваться в центральном участке клетки и контактировать с лизосомами, липидами и митохондриями. Митохондрии в клетке на данной стадии также формировали единую разветвленную сеть. С помощью микроскопии серийных срезов был получен срез ботросомы, которая так же, как и на вегетативной стадии была образована складками гладкого эндоплазматического ретикулума. Анализ изображений трехмерной реконструкции стадии не разошедшихся зооспор также выявил единую сеть митохондрий, расположенных по периферии клетке. Парануклеарное тело в не разошедшихся зооспорах образует разветвлённую структуру, располагающуюся в пространстве всей клетки и контактирующую с разными клеточными структурами. Полученные данные позволяют предположить, что реорганизация органелл играет важную роль при переходе от стадии вегетативной клетки к спорангию и формированию зооспор. 3. Проведена реконструкция метаболических сетей биосинтеза вторичных метаболитов с акцентом на биотехнологически важные жирные кислоты и их производные. Получены данные для трех видов протистов: Aplanochytrium kerguelense sp. PBS07, Hondaea fermentalgiana sp. CCAP_4062/3 и T. aureum ssp. strugatskii. Для T. aureum ssp. strugatskii выявлено 60 ферментативных последовательностей, ассоциированных с путями биосинтеза жирных кислот, для A. kerguelense sp. PBS07 – 43, и для H. fermentalgiana sp. CCAP_4062/3 – 29. Проведенная реконструкция метаболических сетей биосинтеза жирных кислот у трех изученных видов — Thraustochytrium aureum ssp. strugatskii, Aplanochytrium kerguelense sp. PBS07 и Hondaea fermentalgiana sp. CCAP_4062/3 — выявила как общие черты, так и существенные различия в их ферментативном составе, что отражает адаптационные стратегии этих организмов к синтезу липидов. T. aureum ssp. strugatskii демонстрирует наибольшую метаболическую гибкость и, вероятно, наибольший потенциал для синтеза разнообразных липидов, включая полиненасыщенные жирные кислоты; A. kerguelense занимает промежуточное положение, сохраняя большинство ключевых функций; H. fermentalgiana, судя по составу, может быть более специализирован на переработке и удлинении существующих жирных кислот, возможно, получаемых из окружающей среды. Эти различия могут отражать экологические ниши и физиологические стратегии каждого вида, что необходимо выяснить в дальнейшем с использованием омиксных данных. 4. Проведены эксперименты по липофекции и электропорации T. aureum spp. strugatskii для тестирования методов трансформации. Эксперименты были проведены на трех видах протистов: T. aureum spp. strugatskii, T. kinnei и T. caudivorum. Всего было проведено 12 экспериментов с разными условиями. В результате мы получили 11 клонов, однако, несмотря на использование селективных антибиотиков, полученные клоны не были трансгенными. Для дальнейших экспериментов по трансгенезу протистов есть несколько потенциальных методических модификаций протоколов: 1) тестирование комбинаций условий электропорации (предобработка мембран клеток, вольтаж, длительность и кратность импульсов), 2) использование промоторов генов, отличных от GAPDH, таких как EF1α, убиквитин, PGK, тубулин и актин, 3) изменение терминаторной области трансгена, 4) замена репортерного гена EGFP на другой, так как мы наблюдаем автофлуроресценцию в этом диапазоне. В итоге, для успешной генетической модификации протистов необходимо проведение дополнительных экспериментов. Наши результаты показывают, что T. aureum ssp. strugatskii имеет хороший потенциал для того, чтобы служить модельным организмом для системных исследований простейших, а также как потенциальный продуцент биотехнологически ценных веществ. По результатам проекта опубликованы две статьи в журнале International Journal of Molecular Sciences (Q1): обзор, посвященный траустохитридам (https://doi.org/10.3390/ijms252313172) и статья со всесторонним описанием T. aureum ssp. strugatskii (https://doi.org/10.3390/ijms262311302).