Использование люминесцентных бактерий для мониторинга токсичности оксоанионов селена и их биотрансформации

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 24-24-20001

НазваниеИспользование люминесцентных бактерий для мониторинга токсичности оксоанионов селена и их биотрансформации

Руководитель Кудряшева Надежда Степановна, Доктор физико-математических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук" , Красноярский край

Конкурс №90 - Конкурс 2024 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами» (региональный конкурс)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-107 - Экология биосистем

Ключевые слова селен, оксоанионы селена, селенит натрия, наночастицы селена, токсичность, биотест, люминесцентные бактерии, Photobacterium phosphoreum, биотрансформация, детоксификация, редокс-процессы, ферментативные реакции, активные формы кислорода

Код ГРНТИ34.27.23

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Селен – жизненно важный микроэлемент. Он включен в активные центры различных ферментов, в основном оксидоредуктаз, и защищает организм от окислительного стресса. Однако в высоких концентрациях селен остро токсичен; токсичное содержание селена отличается от необходимого содержания всего на один порядок. Самыми токсичными формами селена являются его оксоанионы - селенат и селенит. Природное загрязнение селеном происходит в результате выветривания богатых селеном горных пород и почв, извержения вулканов. Кроме того, высвобождение селена происходит при сжигании ископаемого топлива, добыче полезных ископаемых, сельскохозяйственной деятельности, использовании ядерного топлива. Попадая в воздух в виде оксидов, селен солюбилизируется и переходит в почву и воду в виде оксоанионов. Основными источниками загрязнения оксоанионами селена в Красноярском крае являются тепловые электростанции и горнодобывающие производства, такие как разрезы Канско-Ачинского угольного бассейна, Олимпиадинский ГОК, рудные шахты Норильского промышленного комплекса. На территории края находятся 18 тепловых электростанций, большая часть из которых работает на буром угле. В природе действует полный биогеохимических цикл соединений селена, одну из ключевых ролей в котором играют бактерии. В первую очередь бактерии восстанавливают оксоанионы селена, которые включаются в метаболические процессы. При превышении содержания селена в окружающей среде происходит переключение метаболизма бактерий на нейтрализацию избыточной концентрации оксоанионов селена. Часто восстановленный с помощью бактерий селен образует наночастицы. Способность формировать наночастицы при восстановлении оксоанионов селена перспективна для различных областей биотехнологии, в основном в медицине. Бактериально синтезированные наночастицы селена могут быть использованы в качестве пищевых добавок. Проект направлен на изучение механизма токсичности и биотрансформации соединений селена (в виде селенита) морскими люминесцентными бактериями Photobacterium phosphoreum и характеризуется как фундаментальной, так и практической значимостью. Исследования будут проводиться с использованием комплекса микробиологических, биохимических и спектроскопических методов. Авторы планируют оценку токсического эффекта селенита натрия, детоксицирующей способности бактерий, а также выявление роли ферментативных редокс-процессов и роли активных форм кислорода (АФК) в ходе процесса биотрансформации селенита бактериями. Интенсивность биолюминесценции будет использоваться в качестве физиологического параметра для мониторинга воздействия селенита на бактерии; содержание АФК будет определяться в бактериальных суспензиях с помощью хемилюминесцентного люминольного метода. Будут установлены связи между интенсивностью биолюминесценции бактерий, эффективностью ферментативных реакций и изменением содержания АФК в бактериальных суспензиях при различных временах инкубирования бактерий с селенитом. Визуализация продуктов биотрансформации селенита будет осуществлена с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Кроме того, исследование биообразцов будет проведено с помощью методов молекулярной спектроскопии: ИК-фурье-спектроскопии и спектроскопии комбинационного рассеяния. Будут подобраны условия для микробиологического синтеза наночастиц селена: проведен подбор оптимальных условий, разработана схема выделения частиц из бактериальных клеток и их очистки. Будет проведено определение токсичности суспензий наночастиц, содержания АФК в системах бактерии+наночастицы селена, влияния наночастиц на эффективность ферментативных процессов. Проект связан с прикладным аспектом – использованием люминесцентных бактерий в качестве полифункционального биопрепарата (биореактора) для мониторинга токсичности селен-содержащих водных объектов, снижения токсичности в результате биотрансформации селенита в элементарный селен, возможного биосинтеза наночастиц селена.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Настоящее исследование выявило (1) активационные и токсические эффекты селенита натрия на биолюминесценцию – физиологическую функцию светящихся морских бактерий, (2) биотрансформацию селенита в наночастицы селена(0). Результаты исследования представляют собой как фундаментальный, так и практический интерес. Светящиеся морские бактерии Photobacterium phoshporeum широко используются в качестве биотеста благодаря удобству, простоте и высокой скорости регистрации физиологической функции – свечения. Исследовано влияние селенита натрия (Na2SeO3) на интенсивность биолюминесценции бактерий при различных концентрациях и временах воздействия Na2SeO3. Выявлены и проанализированы активация и ингибирование биолюминесценции; зависимости доза-эффект соответствуют модели гормезиса. Токсичность Na2SeO3 характеризовалась эффективной концентрацией 10-3 М. Изучено влияние Na2SeO3 на содержание активных форм кислорода (АФК) в бактериальных суспензиях. Обнаружены высокие положительные корреляции между интенсивностью биолюминесценции и содержанием АФК, что указывает на решающую роль АФК и связанных с ними окислительно-восстановительными процессами в биоэффектах ионов селенита. В работе освещается и биохимический аспекты токсичности соединений селена. В качестве модельного редокс-активного соединения был выбран тот же селенит натрия (Na2SeO3); в качестве модельного биохимического процесса была использована ферментативная система, выделенная из светящихся морских бактерий. Мы продемонстрировали, что Na2SeO3 подавляет биолюминесценцию ферментной системы; концентрация, ингибирующая биолюминесценцию на 50% составляла 10-2 М. Таким образом, ферментативные процессы вносят вклад в токсический эффект Na2SeO3, определенный с помощью бактериальной тестовой системы. Кроме того, Na2SeO3 снижал содержание АФК в водных растворах (в средах, не содержащих ферментов) при >10-3 М. Добавление ферментов и их субстратов в эти растворы усиливало это снижение. Корреляции между зависимостями содержания АФК и интенсивности биолюминесценции от концентрации Na2SeO3 были положительными и высокими, что подтверждает участие АФК в подавлении ферментативной биолюминесценции в растворах Na2SeO3. Сканирующая и просвечивающая электронные микроскопии продемонстрировали наличие наночастиц в бактериях, подвергшихся воздействию Na2SeO3. Энергодисперсионный спектр выявил высокое содержание селена в наночастицах. Распределение частиц по размерам зависело от концентрации Na2SeO3; максимумы распределения по размерам находились в пределах 45-55 нм. Прикладной аспект исследования связан с использованием люминесцентных бактерий в качестве полифункционального биологического продукта для (1) мониторинга токсичности селен-содержащих водных сред, (2) детоксикации селен-содержащих водных сред, (3) биотрансформации ионов селенита в наночастицы селена. Прикладной аспект работы чрезвычайно важен для мониторинга токсичности и биоремедиации водоносных горизонтов, загрязненных соединениями селена, а также для ряда областей биотехнологии, таких как нанобиотехнологии, производство пищевых добавок и продуктов, обогащенных селеном. Таким образом, применение люминесцентных бактерий в нанобиотехнологиях заслуживает дальнейшего развития. Наблюдаемая высокая чувствительность P. phosphoreum к селениту по сравнению с другими микроорганизмами является дополнительным фактором, облегчающим его использование в качестве тест-объекта для биолюминесцентного мониторинга загрязнения селеном. Кроме того, биотрансформация растворимых форм селена представляет фундаментальный интерес с точки зрения понимания роли микроорганизмов в миграции соединений селена и в микробной экологии. По результатам выполненной работы было опубликовано 2 статьи в журналах, индексируемых в российских и зарубежных базах данных; одна из статей имеет квартиль Q2. Информация об проекте освещалась в СМИ: https://russian.rt.com/science/article/1348676-bakterii-selen-nanochasticy-otkrytie?ysclid=m4856r29e6833917762 https://наука.рф/news/bakterii-svetlyachki-smogli-sozdat-nanochastitsy-selena/ https://kras.mk.ru/science/2024/08/02/krasnoyarskie-uchenye-nashli-bakterii-proizvodyashhie-poleznye-nanochasticy.html

Публикации

1. Зеньков А.В., Сушко Е.С., Кудряшева Н.С. LUMINESCENT BACTERIA AS COMPLEX TOOL FOR MONITORING AND DETOXIFICATION OF SELENIUM POLLUTIONS AND BIOSYNTHESIS OF SELENIUM NANOPARTICLES Biophysical reviews, Springer (год публикации - 2025)

2. Екатерина С. Сушко, Андрей В. Зеньков, Надежда С. Кудряшева Effects of selenite-ions on luminescence enzymatic system. Eurasian Journal of Chemistry, Vol. 29 No. 3 (115), 65-71. (год публикации - 2024)
10.31489/2959-0663/3-24-6

3. Надежда С. Кудряшева, Екатерина С. Сушко, Андрей В. Зеньков. Monitoring of Selinite-Ions and Biosynthesis of Selenium Nanoparticles. International Conference on Advanced Nanomaterials and Nanotechnology 7 Bell Yard, London WC2A 2JR, UK, Abstracts of International Conference on Advanced Nanomaterials and Nanotechnology, Abstracts of International Conference on Advanced Nanomaterials and Nanotechnology, November 14-15, 2024 in Rome, Italy. in Rome, Italy. P.51 (год публикации - 2024)

4. Кудряшева Н.С., Сушко Е.С., Зеньков А.В. Морские люминесцентные бактерии: мониторинг токсичности селенит-ионов и биосинтез наночастиц селена. Белорусский государственный университет. Управление редакционно-издательской работы. Пр. Независимости, 4, 220030, Минск. (год публикации - 2024)

5. Сушко Е.С., Степин Е.А., Кичеева А.Г., Внукова Н.Г., Чурилов Г.Н., Кудряшева Н.С. BIOLOGICAL ACTIVITY OF FULLERENOLS OF VARIOUS STRUCTURE VIA BIOLUMINESCENT MONITORING. THE ROLE OF REACTIVE OXYGEN SPECIES. Biophysical reviews, Springer (год публикации - 2025)

6. Андрей В. Зеньков, Екатерина С. Сушко, Ольга А. Могильная, Михаил Н. Волочаев, Александр В. Шабанов, Александр А. Камнев, Анна В. Тугарова, Надежда С. Кудряшева, Application of the luminous bacterium Photobacterium phosphoreum for toxicity monitoring of selenite and its reduction to selenium(0) nanoparticles Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, Volume 325, 2025, 125078 (год публикации - 2025)
10.1016/j.saa.2024.125078

7. Зеньков А.В. Использование люминесцентных бактерий для мониторинга токсичности растворов селенита натрия и их детоксикации путем синтеза наночастиц селена Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского" , Биосистемы: организация, поведение, управление: Тезисы докладов 77-й Международной школы-конференции молодых ученых (Н. Новгород, 15–19 апреля 2024 г.). Н. Новгород, Университет Лобачевского. 2024. 425 с., с. 141, (год публикации - 2024)

8. Кудряшева Н.С., Сушко E.S., Кичеева А.Г., Колесник О.В., Зеньков А.В., Мартынова А.A. Использование люминесцентных бактерий в нанобиотехнологии: мониторинг биологической активности и биосинтез наночастиц. Нижний Новгород: ННГУ им. Н.И. Лобачевского, , Нижний Новгород: ННГУ им. Н.И. Лобачевского, (год публикации - 2024)

9. А. В. Зеньков, Е. С. Сушко, Н. С. Кудряшева Использование морских люминесцентных бактерий для мониторинга токсичности растворов селенита натрия и их детоксикации путем биосинтеза наночастиц селена Издательство Дальневосточного федерального университета, Генетические технологии в исследованиях природных соединений. II Всероссийская научная школа-конференция молодых ученых и студентов, Владивосток, 23–28 сентября 2024 г. : тезисы докладов / ТИБОХ ДВО РАН. – Владивосток: Издательство Дальневосточного федерального университета, 2024. – [114 с.]. – ISBN 978-5-7444-5806-5. – DOI https://doi.org/10.24866/7444-5806-5. – URL: https://www.dvfu.ru/science/publishing-activities/catalogue-of-books-fefu/. – Дата публикации: 01.11.2024. – Текст. Изображение: электронные. страница 77 (год публикации - 2024)
0.24866/7444-5806-5.

10. Зеньков А.В., Кудряшева Н.С. БИОРЕМЕДИАЦИЯ И МОНИТОРИНГ ДЕТОКСИКАЦИИ СЕЛЕНОВЫХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫМИ БАКТЕРИЯМИ В книге: Экобиотех-2025. Материалы VIII Всероссийской конференции с международным участием. Уфа, 2025. , Экобиотех-2025. Материалы VIII Всероссийской конференции с международным участием. Уфа, 2025. С. 79. (год публикации - 2025)

11. Зеньков А.В. Биотестирование и биотрансформация оксоанионов селена светящимися бактериями Федеральный исследовательский центр "Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук", Красноярск, Министерство науки и высшего образования РФ ФИЦ «Красноярский научный центр СО РАН» Институт физики им. Л. В. Киренского СО РАН Институт биофизики СО РАН Институт химии и химической технологии СО РАН Институт вычислительного моделирования СО РАН Институт леса им. В. Н. Сукачёва СО РАН Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера Институт космических технологий СО РАН Тезисы докладов Междисциплинарной конференции молодых учёных ФИЦ КНЦ СО РАН (КМУ-XXVIII)? c.64 (год публикации - 2025)

12. Зеньков А.В., Сушко Е.С., Кудряшева Н.С. Двойная функция морских люминесцентных бактерий в растворах селенита: биотестирование и биоремедиация Известия ВУЗов. Прикладная химия и биотехнология (год публикации - 2025)

13. Кудряшева Н., Сушко Е., Зеньков А. Application of Luminous Marine Bacteria for Monitoring Toxicity of Selinite-Ions and Biosynthesis of Selenium Nanoparticles Bool of abstracts, SRH Berlin | University of Applied Sciences, Germany Pagicle Ltd, 128 City Road, London, United Kingdom, EC1V 2NX, Book of Abstracts, p.8 and 72 (год публикации - 2025)

14. Кудряшева Н.С., Сушко Е.С., Кичеева А.Г. , Колесник О.В., Зенков В.В. APPLICATION OF LUMINOUS BACTERIA IN NANOBIOTECHNOLOGY AND BIOMEDICINE: MONITORING OF BIOLOGICAL ACTIVITY AND BIOSYNTHESIS OF NANOPARTICLES Воок of abstract, Book of Abstracts of the 4th International Conference on Medical Optics (MEDOPTICS-2025), Turkey, P.12 (год публикации - 2025)

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В течение второго года выполнения проекта проанализирована эффективность детоксикации растворов селенита натрия (Na2SeO3) люминесцентными бактериями Photobacterium phosphoreum. С помощью спектрофотометрического метода показано, что при максимальном времени инкубирования Na2SeO3 с бактериями (24 часа) эффективность биовосстановления оказалась равной 56%, 34% и 65% для растворов с исходной концентрацией селенита 0,1 мМ, 0,5 мМ и 1,0 мМ, соответственно. Эффективность биовосстановления Na2SeO3 с помощью P. phosphoreum оказалась сопоставима с эффективностью других видов селеновосстанавливающих бактерий, что делает вид морских люминесцентных бактерий подходящим кандидатом для ремедиационных мероприятий. Регистрировали кинетику биолюминесценции P. phosphoreum в растворах Na2SeO3 после их биовосстановления (Для биовосстановления использовали 3 исходных концентрации Na2SeO3 – 0,1 мМ, 0,5 мМ и 1,0 мМ). Показано, что кинетика биолюминесценции бактерий в биовосстановленных растворах Na2SeO3 значительно отличается от кинетики биолюминесценции в исходных (невосстановленных) растворах. Таким образом, на примере Na2SeO3 мы показали, что бактерии активно участвуют в биовосстановлении токсикантов окислительной природы, изменяя токсические и активирующие характеристики среды. Таким образом, двойная функция светящихся бактерий объединяет (1) мониторинг окружающей среды в режиме реального времени с (2) активной нейтрализацией токсикантов. Определены скорости окислительно-восстановительных процессов, катализируемых бактериальными ферментами, при различных концентрациях Na2SeO3. Для этого с помощью спектрофотометрического метода исследовано влияние селенита на скорость окисления НАДН в двух ферментативных системах: (А) в моноферментной реакции НАДН:ФМН-оксидоредуктазы и (Б) биферментной системе НАДН:ФМН-оксидоредуктазы – люцифераза. Наблюдали падение скорости окисления НАДН в обеих системах с ростом концентрации Na2SeO3, что предположительно объясняли дезактивацией активных групп ферментов под действием окислителей. Аналогичные зависимости от концентрации Na2SeO3 наблюдали также для содержания Активных Форм Кислорода (АФК) в этих ферментативных системах и для интенсивности биолюминесценции в биферментной системе, что демонстрирует взаимосвязь наблюдаемых редокс-процессов в ферментативных системах в присутствии Na2SeO3. Проводили анализ скоростей окисления НАДН, Vrel, (в биферментной и моноферментной системах) и интенсивности биолюминесценции Irel с учетом биовосстановления селенита, т.е. в присутствии наночастиц селена (БиоSeНЧ). Обнаружено небольшое (<50%) но достоверное увеличение Irel и Vrel при добавлении БиоSeНЧ в широком интервале их низких концентраций (10-9 – 10-2 г/л). Этот эффект демонстрирует каталитическую активность БиоSeНЧ в ферментативных процессах, связанную вероятно с восстановительными свойствами этих наночастиц и их активной поверхностью. Проведена работа по оптимизации условий культивирования бактерий для получения наночастиц селена и их очистки; подобраны концентрации клеток, начальные концентрации селенита, условия инкубации, режим центрифугирования и др. Вместе с тем, полученные результаты можно считать предварительными. Требуются дальнейшие исследования для оптимизации методики и повышения ее эффективности. Проведена характеристика полученных наночастиц селена с помощью сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии, а также спектроскопии комбинационного рассеяния света (СЭМ, ПЭМ и КРС, соответственно). Микрофотографии СЭМ и ПЭМ показали наличие электронноплотных сферических образований, локализованных вероятно, как снаружи, так и внутри клеток. Энергодисперсионный спектр подтвердил состав наночастиц – преимущественное содержание селена. На спектрах, полученных с использованием спектров КРС, показано, что в образцах биомассы клеток присутствует пик при 248 см-1, что свидетельствует о наличии в образцах селена в аморфной модификации. На спектре контрольного образца биомассы данный пик отсутствует. С помощью биолюминесцентного бактериального биотеста изучены токсические характеристики наночастиц селена. Наблюдали активацию биолюминесценции (Irel >1) при концентрациях наночастиц 10-3 – 10-1 г/л. При этом активация биолюминесценции не сопровождалась изменением содержания АФК. Ингибирования биолюминесценции не наблюдали, следовательно, в условиях эксперимента наночастицы нетоксичны. Следует отметить, в аналогичных условиях эффективные концентрации ингибирования бактериальной и ферментативной биолюминесценции селенитом натрия, ЕС50 и IС50, составляли 10-2 и 10-3 моль/л, соответственно. Этот факт указывает на значительные различия токсических характеристик селенита натрия и продукта его биовосстановления – БиоSeНЧ. По результатам 2-ого года работы над проектом имеется 2 публикации в научных журналах (международном Q2/Q1 и российском). Результаты работы были доложены на 4-х конференциях различного уровня – международных, российской и региональной студенческой.

Публикации