Аннотация результатов, полученных в 2024 году
1. В соответствии с планом первого года исследований разработана оригинальная клеточная модель медь-зависимой нейродегенерации с использованием компонентов нейроваскулярной единицы in vitro (астроцитов, эндотелиальных клеток и нейронов) и добавлением хлорида меди непосредственно в среду культивирования. 2. Определены токсические и субтоксические концентрации ионов меди на жизнеспособность культивированных клеточных компонентов нейроваскулярной единицы. Показано, что выживаемость культивированных астроцитов коры головного мозга крыс при действии Cu2+ (50, 100, 200 мкМ, 24 ч) достоверно снижается (до 83±2, 75±3% и 45± 3%, соответственно p<0,01 по сравнению с контролем (0 мкМ Cu2+)). Воздействие Cu2+ (100 мкМ, 24 ч) приводило к повреждению и сжатию клеток, содержащих GFAP, и части клеток, содержащих глутаминсинтазу или виментин. При фазово-контрастной микроскопии при добавлении Cu2+ в токсической концентрации в среду культивирования наблюдалось повреждение плотного клеточного монослоя и ошаривание части астроцитов. Для культивированных зернистых нейронов мозжечка достоверное снижение выживаемости, выражающееся в появлении большого количества сжатых пикнотических ядер погибших клеток вместо нейронов с нормальной морфологией, начинается, когда концентрация Cu2+ в среде культивирования достигает 25 мкМ до 89±2%. Более высокие концентрации Cu2+ 50 и 100 мкМ снижали выживаемость этих клеток до 65±4% и 15±2% соответственно. В отличие от культур астроцитов и нейронов морфологически повреждение монослоя эндотелиальных клеток при токсическом воздействии ионов меди не столь выражено. В фазовом контрасте заметны отдельные пикнотическия ядра погибших клеток, увеличение числа макрофагальных клеток и тяжей узких клеток в пределах монослоя. В МТТ -тесте показано, что за 24 часа выживаемость клеток в эндотелиальных культурах при действии 100, 200, 300 мкМ Cu2+ достоверно снижается до 84±2, 84±4% и 64±4% соответственно. 3. Получены данные о влиянии физиологических вариаций рН на жизнеспособность клеточных компонентов нейроваскулярной единицы при токсическом действии ионов меди in vitro. Обнаружено, что токсическое действие Cu2+на нейроны и астроциты возрастает при закислении среды инкубирования, что может быть связано с усилением транспорта Cu2+в клетки. Для культивированных зернистых нейронов при рН 6,8 повреждающее действие Cu2+ проявляется уже при концентрации 10 мкМ, а выживаемость снижается до 81±3%, а при 25 мкМ Cu2+ до 63±4%, тогда как этот показатель при рН 7,3 составляет 95±2 и 89±2%% соответственно. Для астроцитов при кислом значении рН среды культивирования (рН 6,8) по сравнению с нейтральным (рН 7,3) при 50 мкМ Cu2+ различие составляло 14%, p<0,05 (МТТ-тест). В культурах эндотелиоцитов была выявлена тенденция снижения выживаемости (МТТ-тест) на 9% при кислом значении рН среды культивирования (рН 6,8) по сравнению с рН 7,3. Однако при действии Cu2+ при всех исследуемых концентрациях (25-300 мкМ) эта тенденция не только не нарастала, но даже нивелировалась. Таким образом, при Cu2+ 300 мкМ выживаемость эндотелиоцитов была одинаковой, как при различных значениях рН среды культивирования (6,8 и 7,3). 4. Воздействие Cu2+ вызывает в отдельных астроцитах, нейронах и эндотелиоцитах выраженную экспрессию маркерного белка аутофагии LC3b. 5. Митохондрии культивированных астроцитов и клеток эндотелия многочисленны и представляют собой длинные изогнутые тяжи, образующие сеть. В культурах, обработанных хлоридом меди, появлялись клетки с фрагментированными митохондриями. Митохондрии зернистых нейронов мозжечка, окрашенные родамином 123, при конфокальной микроскопии очень мелкие светящиеся палочки или точки. Электронно-микроскопическое исследование культивированных нейронов при действии Cu2+ (100 мкМ, 5 ч) не выявило видимых изменений митохондрий этих клеток. Отмечалось небольшое просветление матрикса митохондрий в некоторых обработанных Cu2+ культурах, видимо, основные изменения происходят позже (24 ч). Обнаружено, что все основные клеточные компоненты нейроваскулярной единицы отвечают на токсическое действие Cu2+ снижением мембранного потенциала митохондрий. Наблюдалось снижение мембранного потенциала митохондрий астроцитов на 38±5% (100 мкМ Cu2+, 24 ч) от контрольного уровня соотношения флуоресценции JC-1 в красном спектре к флуоресценции в зеленом спектре (*p<0,0001 n = 17-18), а у нейронов (50 мкМ Cu2+, 24 ч) на 19±4%. Присутствие Cu2+ (200 и 300 мкМ, 24 ч) в среде культивирования достоверно снижает мембранный потенциал митохондрий клеток эндотелия до 84±5% и 56±5% соответственно. 6. Достоверного увеличения уровня свободного цитоплазматического кальция с использованием специфического флуоресцентного зонда Fluo-4 во всех исследованных типах клеток нейроваскулярной единицы (астроциты, клетки эндотелия и нейроны) при действии Cu2+ выявлено не было. Относительное значение интенсивности флуоресценции зонда в цитоплазме клеток контрольных культур принимали за 100%, тогда как на фоне Cu2+ этот параметр составлял 106±2% для нейронов (50 мкМ Cu2+), 112±10% для астроцитов (100 мкМ Cu2+), а в случае эндотелиоцитов даже понижался (200-300 мкМ Cu2+). 7. Выявлена тенденция увеличения продукции активных форм кислорода на 20% в астроцитах в присутствии хлорида меди (100 мкМ, 24 ч) по соотношению флуоресценций специфического зонда на супероксиданион MitoSOX Red и ядерного красителя Hoechst. 8. Добавление в среду культивирования лактата натрия (1 мМ, 24 ч) увеличивало выживаемость астроцитов при действии Cu2+ (100 мкМ - на 21%,*p<0,05), но снижало выживаемость нейронов (при Cu2+ 50 мкМ - на 15%). 9. В присутствии глутатиона (1 мМ) или цистеина (1 мМ) даже наномолярные концентрации меди (0,5 мкМ) вызывают 100% гибель культивированных нейронов.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
На разработанной модели болезни Вильсона-Коновалова in vitro, включающей в себя изучение действия ионов меди на отдельные компоненты нейроваскулярной единицы (нейроны, астроциты и клетки эндотелия коры головного мозга) показано, что: 1) обработка астроцитов Cu2+ (100 мкМ, 24 ч) приводит к увеличению площади ядрышка с 1,35±0,04 до 2,47±0,1 мкм2, а эндотелиоцитов Cu2+ (200 мкМ) - с 1,33±0,07 до 1,71±0,09 мкм2, при этом размер ядер в контрольных и обработанных клетках оставался одинаковым на препаратах, окрашенных акридиновым оранжевым; 2) медь (100 мкМ, 24 ч) вызывает изменения ультраструктуры ядрышек астроцитов. Наблюдалось перераспределение плотного фибриллярного компонента к периферии ядрышка и общая дезорганизация структуры ядрышка; 3) в ядрышках астроцитов контрольных культур наблюдается практически полная колокализация нуклеофозмина и фибрилларина, тогда как при действии Cu2+ (100 мкМ, 24 ч) область окрашивания нуклеофозмина более обширна и выходит за пределы области локализации фибрилларина. В контрольных клетках фибрилларин выявляется в ядрышках преимущественно в виде специфических скоплений, тогда как в обработанных клетках скопления фибрилларина теряют четкие контуры. В эндотелиоцитах различий по этим белкам между контрольными и обработанными медью культурами не выявлено; 4) после обработки медью уровень р53 в ядрах достоверно повышается как в астроцитах, так и в эндотелиоцитах; 5) происходит достоверное снижение трансэндотелиального электрического сопротивления монослоя эндотелиоцитов на полупроницаемой мембране при концентрации меди в среде преинкубации 50 мкМ и выше, а проницаемость для флуоресцентного красителя люциферового желтого возрастала при 100 мкМ; 6) Cu2+ (100 мкМ) вызывают достоверное снижение образования петель и уменьшение общей длины отростков из клеток эндотелия при исследовании ангиогенеза клеток в «Angiogenesis Assay Kit»; 7) в среде клеточных культур астроцитов базальный уровень нитритов, реагирующих с реактивом Грисса, по которому судят о количестве NO, составлял 4,7±0,6 мкМ, а эндотелиоцитов - 1,43±0,15 мкМ. В астроцитарных культурах добавление в среду культивирования Cu2+ (25-200 мкМ) не оказывало достоверного влияния, тогда как добавление липополисахарида (ЛПС, 30 мкг/мл) достоверно повышало этот параметр до 47±2,7 мкМ. Внесение в среду культивирования Cu2+ (25 и 50 мкМ) на фоне действия ЛПС достоверно увеличивало накопление NO до 66±5,6 и 55±6 мкМ, соответственно. В эндотелиальных культурах Cu2+ (100-300 мкМ) не оказывали достоверного воздействия на уровень NO, а добавление ЛПС (30 мкг/мл) достоверно повышало этот параметр до 2,23±0,58 мкМ. Внесение в среду культивирования Cu2+ на фоне действия ЛПС не вызывало достоверного повышения NO в среде инкубации эндотелия; 8) выживаемость клеток достоверно дозозависимо снижалась при добавлении 50 мкМ и более Cu2+ в среду культивирования астроцитов и более 100 мкМ для эндотелиоцитов. ЛПС в используемых нами концентрациях не влиял на выживаемость клеток; 9) в контрольных и обработанных Cu2+ культурах присутствует значительное число отросчатых микроглиальных клеток, тогда как в культурах, обработанных ЛПС или ЛПС+Cu2+, преобладали клетки микроглии с амебоидной морфологией, характерной для активированной микроглии. Под действием ЛПС происходило достоверное увеличение площади профильного поля тела и периметра клеток, что также характерно для активированной микроглии. Cu2+ (25 мкМ) не влияли на эти параметры. 10) базальный уровень NO в среде инкубирования клеточных культур нейронов коры головного мозга составлял 5,7±0,4 мкМ. Добавление в среду культивирования Cu2+ в интервале концентраций 100-300 мкМ не оказывало достоверного воздействия на этот параметр, тогда как добавление ЛПС достоверно повышало уровень NO до 15±2 мкМ. Внесение в среду культивирования Cu2+ (100 мкМ) совместно с ЛПС вызывало достоверное снижение нитрита в среде инкубации. 11) в присутствии ЛПС снижалась гибель нейронов, вызванная 50 мкМ или 100 мкМ Cu2+, на 41% и 31% , соответственно (оценивали выживаемость зернистых нейронов мозжечка, подсчитывая количество морфологически интактных нейронов на гистологических препаратах). 12) 100 нг/мл фактора роста нервов (NGF) снижает выживаемость (метаболизм МТТ) в культурах астроцитов в отсутствие Cu2+ на 22±2%. При токсическом действии Cu2+ защитного действия NGF на астроциты и нейроны не обнаружено. ЗАКЛЮЧЕНИЕ: В ходе исследования обнаружено, что в астроцитах Cu2+ вызывают гипертрофию ядрышек, изменение ультраструктурной организации ядрышек, нарушение локализации фибрилларина и нуклеофозмина/B23, а также накопление р53 в ядрах, что соответствует концепции развития ядрышкового стресса. Таким образом, основываясь на наших результатах, можно предположить, что ядрышковый стресс участвует в развитии нейродегенерации при болезни Вильсона-Коновалова. В эндотелиоцитах Cu2+ также вызывают гипертрофию ядрышек и накопление р53 в ядрах. Таким образом, основываясь на наших результатах, можно предположить, что вызванные медью изменения в ядрышках клеток могут представлять собой универсальный клеточный ответ, связанный с контролем качества рибосом и регуляцией клеточной судьбы. Полученные в ходе выполнения проекта результаты показали новое направление в механизмах развития купроптоза, который происходит в клетках нейроваскулярной единицы, сопровождающийся развитием ядрышкового стресса и нарушением проницаемости ГЭБ. Возможна частичная коррекция процессов в присутствии индуктора воспаления липополисахарида, но не фактора роста нервов.