Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Методом наносекундной лазерной абляции были получены и охарактеризованы наночастицы (НЧ) серебра, меди и селена в различных жидкостях и смазках. Выбранные основы для наногелей включали в себя глицерин (дистиллированный, пищевая добавка E442, “Glycerine Solutions”, Москва, Россия), вазелин (Megacos Co., Ltd, Gyeonggi-do, Республика Корея), силиконовое масло (техническая силиконовая смазка ПМС-100, “Комрек”, Москва, Россия), перфторполиэфир (пищевая пластичная смазка SG-394, EFELE, Москва, Россия). В качестве дополнительных сред для сравнения антибактериального эффекта использовались деонизированная вода и изопропиловый спирт. Были отработаны оптимальные методики введения наночастиц в состав смазок. Так, одностадийная генерация наногелей была возможна в глицерине, силиконовом масле, воде и изопропаноле. Вазелин является вязким и непрозрачным веществом, в связи с чем перед абляцией производился его нагрев с помощью паяльного фена при температуре 226° C. В результате происходило его расплавление и повышение прозрачности. В случае использования перфторполиэфира () осуществлялось напыление серебряных, медных и селеновых пленок на стеклянные подложки (доноры), после чего производился прямой лазерно-индуцированный перенос НЧ путем фокусировки лазерного излучения на тыльную строну донорной подложки и ее перепыления на слой ПФПЭ с последующим смешиванием НЧ и смазки. Была произведена характеризация НЧ, полученных в различных растворителях, методами спектроскопии УФ-видимого-ближнего ИК диапазонов, динамического рассеяния света, сканирующей электронной микроскопии, энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии. Согласно СЭМ характеризации, все полученные частицы обладают сферической формой, кроме НЧ селена, полученных в силиконовом масле, которые представляли собой конгломераты наноигл. В большинстве случаев НЧ, полученные в органических средах, демонстрируют высокое содержание углерода, обусловленное составом гелей-носителей. Были изучены омнифобные свойства (смачиваемость) смазок без/с полученными НЧ. Согласно полученным данным, вазелин и силиконовое масло являются подходящими веществами для создания омнифобных поверхностей, в том числе и для предотвращения образования биопленок. Анализ эффективности наногелей на биопленках осуществлялся с использованием штаммов S. aureus (SA), P. aeruginosa (PA), E. Coli (EC), S. epidermidis (SE), K. pneumoniae (KP) и их комбинаций SA+SE+PA, SE+EC и EC+KP, моделирующих раневые инфекции. Для исследования эффекта на планктонных культурах по 1 мл культуры каждого типа смешивалось с 300 мкл коллоида и выдерживалось в течение 1 ч. Для определения эффекта на бактериальных биопленках сначала производилось их выращивание на подложках CaF2 и Au пленках, напыленных на пластинках кремния. Подложки помещались в 24-луночные планшеты, наполненные наногелями, и выдерживались в течение 1 часа, после чего производился смыв и высев бактерий с определением числа КОЕ/мл (колониеобразующих единиц в миллилитре). Эффективность НЧ серебра, меди и селена в воде была показана ранее и подтвердилась в наших экспериментах. Ag НЧ, полученные в глицерине, также показали хороший антибактериальный эффект – популяция бактерий снизилась на четыре порядка в SE, на два – в PA и KP. В комбинированных биопленках эффект достигал трех порядков. Снижение КОЕ/мл после обработки Ag НЧ, полученных в силиконовом масле, в среднем составляло один порядок. НЧ Cu в глицерине подавляли рост бактерий от одного (EC, SE+EC) до двух порядков (SE, PA, EC+KP). Обработка биопленок наночастицами меди в силиконовом масле была менее эффективной и приводила к снижению значений КОЕ/мл на один порядок в SE, PA, SE+EC, EC+KP. НЧ селена в глицерине снижали популяцию на один порядок в SA, PA, EC, SA+SE+PA, EC+KP. Наибольший эффект наблюдался в SE и KP – на три и четыре порядка, соответственно. Обработка биопленок НЧ селена в силиконовом масле привела к снижению КОЕ/мл на три порядка в SA и SA+SE+PA, на два – в SE, EC, KP, EC+KP. Таким образом, эффективность НЧ при их генерации в вязких средах сохранялась и даже увеличивалась в случае селена. Данные бактериологических посевов иллюстрировались ИК спектроскопией пропускания и отражения. После обработки ИК спектров оптической плотности и поглощения были получены значения положения пиков xc, их ширины на 0.5 высоты FWHM и площади под кривой A. В ходе анализа полученных параметров спектральных пиков было показано, что обработка бактериальных биопленок НЧ серебра, меди и селена приводит к одновременному разрушению клеточной мембраны, вторичной структуры белков и нуклеиновых кислот. Анализ главных компонент (Principal component analysis, PCA) был проведен для спектров ИК оптической плотности в диапазоне от 1191 см-1 до 1800 см-1, а также их вторых производных. Было показано, что анализ вторых производных с более высокой точностью дифференцирует бактерии, поврежденные после обработки НЧ и жизнеспособные биопленки. Положительные значения PC1 соответствуют жизнеспособным биопленкам, тогда как отрицательные – их полной или частичной гибели. При сопоставлении PC1 со спектрами ИК оптической плотности выявляются основные молекулярные колебания, которые отвечают за дифференциацию жизнеспособных клеток от нежизнеспособных, а именно PO2, C-O, C-N, C-C, N-H в ДНК/РНК; амиды I и III; CH2, CH3, COO- в липидах; тирозин. Уменьшение вклада α-спиралей в спектрах нежизнеспособных бактерий соотносится с данными Лоренцевой аппроксимации пиков и свидетельствует о нарушении вторичной структуры белка. Аналогично был проведен PCA анализ спектров в диапазоне 2700-3400 см-1, который также позволил дифференцировать жизнеспособные клетки от нежизнеспособных.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В первой части проведенных отчетных работ было впервые продемонстрировано использование коллоидных наночастиц Gd2O3:Yb для гипертермии бактериальных клеток. НЧ были получены методом лазерной абляции микропорошка Gd2O3:Yb с использованием двух ИК-лазерных систем (1064 нм, 1030 нм) с нано- и фемтосекундной длительностью импульса. Показано, что оптимальный режим получения коллоидных растворов НЧ реализуется при фемтосекундной лазерной абляции, что позволяет синтезировать НЧ с бимодальным распределением размеров, со средним диаметром меньшей фракции 10–30 нм. Антибактериальное действие наночастиц (НЧ) было продемонстрировано на грамположительных (S. aureus, S. epidermidis) и грамотрицательных (P. aeruginosa, E. coli, K. pneumoniae) антибиотикорезистентных патогенных бактериях. Применение НЧ привело к снижению популяции бактерий в среднем на 3 порядка без применения гипертермии. Воздействие излучения в ближнем ИК-диапазоне на бактерии с НЧ Gd2O3:Yb приводит к полной стерилизации жидкости, что крайне важно для биомедицинского применения для полной дезинфекции ран, включая лечение хронических ран. Согласно данным микробиологического посева, переход от микро- к наноразмерным частицам приводит к значительному повышению их токсичности как таковой, поскольку использование НЧ приводит к снижению КОЕ/мл на 2–3 порядка без дополнительного лазерного воздействия. Тем не менее, лазерное экспонирование НЧ, добавленных к бактериальным культурам, приводит к полной стерилизации жидкости, что является важным показателем при антибактериальной терапии, в том числе при лечении хронических ран. Во второй части проведенных отчетных работ методы, отработанные и оптимизированные ранее, были применены для исследований антибактериального эффекта раневых повязок на основе НЧ in vivo. Одностадийное формирование наногелей осуществлялось с помощью наносекундного лазера HTF Mark («Булат») с центральной длиной волны λ = 1064 нм, длительностью импульса τ = 120 нс, частотой следования импульсов f = 20 кГц и максимальной энергией Emax = 0,9 мДж. Для исследований in vivo из коллекции Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи были отобраны штаммы, способные образовывать биопленки и вызывать раневые инфекции: S. aureus 15, S. epidermidis 28, P. aeruginosa 32, E. coli 108, K. pneumoniae 27 в виде многокомпонентных биопленок: S. aureus + S. epidermidis + P. aeruginosa, S. epidermidis + E. coli и E. coli + K. pneumoniae. Для формирования биопленочной инфекции в раневом ложе биопленки предварительно выращивали на однослойных марлевых дисках размером 5×5 мм. Для моделирования раневой инфекции использовали мышей Balb/c из вивария, состоявших исключительно из самцов массой 18–20 г. При интерпретации результатов исследования использовали следующие критерии выраженности роста: 1 степень – очень скудный рост (до 10 колоний); 2 степень – скудный рост (10–25 колоний); 3 степень – умеренный рост (не менее 50); 4 степень – обильный, непрерывный рост микрофлоры. Рост колоний 3-й и 4-й степени считался подтверждением значимости роли данного микроорганизма в воспалительном процессе, 1-й и 2-й степени – контаминацией. На основании полученных данных рассчитывались средние значения обсемененности мазков из раневого ложа. Нанесение влажных раневых повязок на основе глицерина и силиконового масла с наночастицами серебра, меди и селена на инфицированные раны мышей Balb/c, сформированные с использованием двух- и трёхкомпонентных биоплёнок, включающих в себя грамположительные (S. aureus, S. epidermidis) и грамотрицательные (E. coli, K. pneumoniae) бактерии, привело к снижению популяции бактерий. Микробиологическая оценка выявила очень скудный рост (до 10 колоний) и скудный рост (10–25 колоний) на шестой день наблюдения у мышей, инфицированных биопленками S. epidermidis + E. coli и E. coli + K. Pneumoniae, и на девятый день у мышей, инфицированных биопленками S. aureus + S. epidermidis + P. aeruginosa. Среднее время заживления в контрольной группе составило 9–12 дней. Процентное сокращение площади раны показало положительную динамику после применения влажных раневых повязок на основе наночастиц.