Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В течение первого года выполнения Проекта были получены, размещены и разделены на группы самцы мышей линии SHK, которым был установлен особый диетарный режим. Подгруппа контрольных мышей в рацион получала стандартный гранулированный корм и агарозные блоки без астаксантина; подгруппа контрольных мышей с совместным получением астаксантина получала стандартный гранулированный корм и агарозные блоки с астаксантином; рацион подгруппы мышей с высокожировой диетой составлял стандартный гранулированный корм, сало и агарозные блоки без астаксантина; подгруппа мышей с высокожировой диетой и совместным применением астаксантина получала стандартный гранулированный корм, сало и агарозные блоки с астаксантином. По достижении части животных возраста шесть месяцев были проведены исследования когнитивных функций животных с помощью поведенческих тестов: открытое поле, а также в программно-аппаратном комплексе «Шелтер» исследовали предпочтение животных темного/светлого отсека, формирование и извлечение памяти с помощью теста на реакцию пассивного избегания. Результаты исследования поведения животных в открытом поле показали, что не было достоверных отличий между подгруппами по показателям горизонтальной активности таких как расстояние, пройденное животным, скорость передвижения животного, а также вымени проведенного животного без движения и в движении. Результаты фиксации вертикальной двигательной активности в открытом поле выявили увеличение количества стоек с опорой у животных с высокожировой диетой с совместным приемом астаксантина по сравнению с контрольной подгруппой животных, что может указывать на повышенную исследовательскую активность этих мышей. Нами не было выявлено достоверных различий между группами животных по показателям частоты и продолжительности груминга. Было выявлено увеличение количества актов дефекации у животных в диету которых входил астаксантин. Тестирование поведения мышей в программно-аппаратном комплексе «Шелтер не выявило достоверных отличий между подгруппами животных в предпочтении животных темного или светлого отсека, а также по количеству переходов между отсеками. При тестировании рефлекса пассивного избегания наши результаты показали, что ни у одной из подгрупп животных не было дефицита долговременной памяти. Как контрольные, так и подопытные животные через 24 часа и 7 дней после электрокожного раздражения в темном отсеке и при последующем помещении их в светлый отсек оставались в нем и не переходили в темный отсек. Дальнейшие морфологические исследования включали в себя оценку нагрузки групп нейронов возрастным пигментом – липофусцином, оценку сохранности нейронов и глиального окружения нейронов методом иммуногистохимического окрашивания срезов мозга. Для оценки нагрузки групп нейронов липофусцином была получена серия объемных изображений на лазерном конфокальном микроскопе Leica SP5, на ткани без применения красителей. Результат исследований нагрузки липофусцином показал, что различный диетарный режим достоверно не влиял на плотность гранул липофусцина на единицу объема ткани ед/мкм3 как в регионе СА1, так и в областях СА3 и DG гиппокампа. Средний размер гранул липофусцина был больше у животных потреблявших астаксантин в регионе СА1 гиппокампа по сравнению с другими подопытными группами животных. В регионах СА3 и DG гиппокампа средний размер гранул липофусцина был ниже у животных находившихся на высокожировой диете и совместном потреблением астаксантина по сравнению с остальными подгруппами. Интенсивность свечения гранул в поле СА1 была достоверно ниже у животных на высокожировой диете по сравнению как с контрольной подгруппой, так и с подгруппами, получавшими астаксантин. Самая яркая интенсивность свечения гранул липофусцина в области СА3 гиппокампа была показана для контрольных животных получавших астаксантин, она была достоверно выше относительно подгрупп контрольных животных, а также животных, получавших высокожировую диету, и животных, получавших высокожировую диету совместно с астаксантином. В поле СА3 было выявлено, что в группе мышей с высокожировой диетой яркость свечения липофусциновых гранул была достоверно ниже, чем в контрольной группе животных. Тогда как, в област DG гиппокампа интенсивность свечения гранул липофусцина была достоверно ниже у мышей, получавших высокожировую диету по сравнению с животными контрольной, контрольной получавшей астаксантин и высокожировой получавшей астаксантин подгруппами. Результаты оценки сохраности нейронов и глиального окружения нейронов гиппокампа получали методом иммуногистохимического окрашивания срезов мозга и последующей конфокальной микроскопии. У шестимесячных животных различный диетарный режим питания достоверно не повлиял на плотность нейронов в областях СА1, СА3 и DG гиппокампа. Результаты оценки микроглиального окружения нейронов не выявили достоверных различий плотности микроглии в гиппокампе в областях CA1, CA3 у животных с различным диетарным режимом. Однако было показано, что плотность микроглии в области DG гиппокампа у контрольных животных получавших астаксантин была достоверно выше относительно контрольных животных. Молекулярно-генетические исследования включали в себя анализ экспрессии генов методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Было показано, что уровень экспрессии мРНК Flot1, Lamp1, а также Nrf2 достоверно не отличалась от контрольной подгруппы у подгрупп животных, получавших астаксантин и животных на высокожировой диете. Тогда как включение в диету астаксантина способствовало снижению уровня мРНК Nfkb по сравнению с контрольной подгруппой. Анализ экспрессии генов, вовлеченных в нейровоспаление выявил снижение уровня мРНК гена Aif, кодирующего белок IBA1, признанного маркера микроглии у подгрупп животных, получавших астаксантин и животных на высокожировой диете по сравнению с контрольной группой. Экспрессия гена Gfap, кодирующего одноименный белок и признанный маркер астроцитов, а также уровни мРНК IL1b и IL6, кодирующих провоспалительные цитокины ИЛ1-бета и ИЛ6 соответственно не отличались от контрольного уровня. Кроме того, мы исследовали экспрессию генов белков, характеризующих состояние митохондрий: деление митохондрий – Drp1, транскрипционный фактор PGC1- α, который регулирует гены, учавствующие в энергетическом метаболизме и является главным регулятором митохондриального биогенеза, а также ген, кодирующий белок Pink1, учавствующий в процессе митофагии. Экспрессия генов Pgc1a и Pink1 у всех подопытных групп достоверно не отличалась от контроля. Однако, было показано повышение уровня мРНК Drp1 в гиппокампе мозга мышей с высокожировой диетой по сравнению с контрольным. Известно, что высокоинтенсивное деление и несвоевременная деградации мелких низкоактивных работающих фрагментов митохондрий и их везикул приводит к развитию воспаления, нейродегенерации.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В Проекте исследовали влияние длительной высокожировой диеты и антиоксиданта астаксантина на состояние гиппокампа в процессе старения мышей. В работе использовали комплексный клеточно-молекулярный и системный подходы: 1) применение разного диетарного режима питания мышей. С возраста трех месяцев животные находились на разных диетах: стандартной диете (СД), высокожировой диете (ВЖД) без или с добавлением в рацион антиоксиданта астаксантина (АСТ) в течение длительного времени, до 12 месяцев. Животные на ВЖД получали 45% калорий из сала, и по этому показателю такой рацион питания был близок к «западной диете» 2) исследование когнитивных функций животных в аппаратно-программном комплексе «Шелтер» и в открытом поле. 3) морфологические исследования по оценке нагрузки групп нейронов возрастным пигментом – липофусцином, а также оценке нейронов и глиального окружения нейронов в гиппокампе с помощью иммуногистохимической окраски и последующей сканирующей лазерной конфокальной микроскопии. 4) Молекулярно-генетические исследования включали в себя анализ экспрессии генов методом ОТ-ПЦР в реальном времени для генов, которые кодируют маркеры воспаления (NfkB, Iba1, Gfap, Il1b, Il6), мембранного обмена и лизосомальной функции (Flot1, Lamp1), а также маркеры состояния митохондрий (Drp1, Pgc1a, PINK1, Nrf2) в гиппокампе мозга мышей возрастом 12 и 15 месяцев с разным диетарным режимом. Результаты показали, что при старении у животных на стандартной диете в областях CA (cornu ammonis) полей 1, 3 гиппокампа, а также зубчатой фасции гиппокампа (ЗФ) наблюдалось возраст-зависимое накопление липофусцина. Однако у животных, находившихся на ВЖД, в гранулярных нейронах зубчатой фасции гиппокампа такого накопления липофусцина не было обнаружено. Липофусцин, представляющий собой неразлагаемый аутофлуоресцентный пигмент, образует агрегаты в цитоплазме и лизосомах долгоживущих постмитотических клеток, нарушая клеточный транспорт и метаболизм, а также способствуя гибели нейронов и активации глии. Нами было подтверждено, что старение сопровождалось нарушением долговременной памяти и развитием хронического нейровоспаления в гиппокампе. При этом ВЖД оказывала умеренное влияние на гиппокампальные изменения по сравнению с животными на стандартной диете. Возрастная динамика активности микроглии, оцененная по Iba1-иммуреактивности, характеризовалась её увеличением в областях CA1, CA3 и ЗФ гиппокампа к 12 месяцам с последующим снижением к 15 месяцам. Введение в рацион астаксантина привело к улучшению выполнения реакции пассивного избегания и оказывало дозозависимый по длительности эффект: применение АСТ в течение менее 6 месяцев способствовало подавлению провоспалительной активности, о чём свидетельствовало снижение экспрессии NF-κB. Однако более длительное непрерывное применение АСТ, напротив, приводило к повышению уровня NF-κB в гиппокампе. Полученные данные свидетельствуют о неоднозначном влиянии ВЖД на головной мозг и подчеркивают важность оптимизации сроков применения антиоксидантов для защиты гиппокампа от нейровоспаления. Общепринято, что нормальное старение мозга характеризуется снижением контроля качества митохондрий. Это проявляется в снижении митохондриального биогенеза, дисбалансе динамики деления/слияния, способствующем чрезмерному делению, и нарушении удаления повреждённых митохондрий (митофагии). Наши результаты не выявили значительного изменения митохондриальной динамики при старении животных, находящихся на нормальной диете. Однако астаксантин существенно повлиял на эту динамику, что следует из изменения экспрессии генов. Так, биогенез митохондрий, который регулируется сигнальным путем PGC-1α (коактиватор гамма-рецептора 1-альфа, активируемого пероксисомами) существенно повысился под влиянием астаксантина в гиппокампе старых мышей. Деление митохондрий более активно было в гиппокампе старых мышей, получавших высокожировую диету вместе с астаксантином, как показывает повышенная экспрессия гена для Drp1 (Dynamin-Related Protein 1). Особое значение имеет повышение экспрессии гена PINK1 (PTEN-induced kinase 1, BRPK, PARK6), кодирующего белок PTEN-активируемую киназу 1, у старых мышей под влиянием астаксантина. Этот белок локализован в мембранах митохондрий и служит сенсором, с помощью которого клетка «чувствует» повреждения этих органелл. Таким образом, астаксантин в наших экспериментах оказал положительное влияние на митохондрии и когнитивные функции стареющих мышей.