Аннотация результатов, полученных в 2024 году
1. Подготовить обзор литературы о доминирующих видах-симбионтах в ульях медоносных пчел касаемо Тюменской области. В результате анализа литературных данных, содержащих сведения о видовом и численном составе акаро- и энтомофауны пчелиных ульев Тюменской области, нами был подготовлен обзор литературы по доминирующим симбионтам в ульях медоносных пчел Тюменской области. Детально изучены методы диагностики (морфологические, молекулярные, серологические) опасных паразитов медоносных пчел – клещей рода Acarapis (A. woodi, A. dorsalis, A. externus). 2. Изучить видовой состав насекомых и клещей – симбионтов пчёл Западной Сибири. В ходе работы по гранту нами было исследовано 130 проб материала (подмора, расплода, восково-перговой крошки со дна ульев, внеульевого сора, сотов) из 20 пасек 7 муниципальных районов Тюменской области (Абатский, Голышмановский, Ишимский, Нижнетавдинский, Тобольский, Тюменский, Ялуторовский) и Алтайского края. Всего в исследованном материале было обнаружено 44 вида и таксона более высокого ранга. 3. Определить объекты для молекулярной диагностики. Из выявленных видов были определены 11 объектов для молекулярной диагностики. Критериями выбора объектов были регулярность встречаемости вида в пчелиных ульях (выбирались облигатные или массовые факультативные виды членистоногих, которые оказывают влияние на функционирование пчелиных семей), а также установленное негативное влияние вида на развитие и жизнедеятельность пчёл (выбирались паразитические и клептопаразитические виды членистоногих-симбионтов медоносных пчёл). 4. Получение лабораторных культур исследуемых объектов. Для подробного изучения биологии, экологии и роли в жизни пчелиной семьи, нами были выделены виды симбионтов, для лабораторного культивирования. Критерием выбора видов была массовая представленность в ульях пчел региона, их потенциальная опасность либо полезная роль в жизни пчел. Также культивировались виды, представленные в исследованных ульях только преимагинальными стадиями, определение по которым невозможно, до появления взрослых особей. Для большинства видов, в литературе отсутствуют сведения по культивации в лабораторных условиях. При подборе способов культивирования таких видов изучали литературу об их биологии, типах питания, режимах температуры и влажности и начинали культивирование в соответствие с этими данными. Каждая проба материала из ульев просматривалась полностью на предмет наличия живых членистоногих. Разные виды обнаруженных симбионтов размещали в контейнеры, указывали № пробы, откуда были извлечены симбионты и их количество. Культивирование проводили в термостате при температуре 25 ˚C. Влажность для каждого вида контролировали индивидуально. Получены лабораторные культуры 15 объектов. 5. Анализ информационных ресурсов по видовым особенностям генетических маркеров у выявленных массовых и доминирующих видам насекомых. Проведен обзор литературы о видовых особенностях для идентификации таксон-специфической ДНК членистоногих-симбионтов медоносных пчёл. В этом году были определены объекты исследования: 8 видов насекомых и 3 вида клещей. Для видовой идентификации насекомых методом ПЦР-ПДРФ была разработана и частично апробирована методика. Для создания методики была проведена работа по поиску фрагмента гена COI выбранных насекомых в базе данных NCBI и BOLD. Информация была найдена для всех насекомых кроме Forficula tomis. 6. Подбор праймеров и ферментов рестрикции для ПДРФ анализа Проведена разработка дизайна эксперимента при использовании биоинформатических методов. Для анализа брались все обнародованные последовательности фрагмента гена COI для каждого перечисленного вида из базы NCBI и BOLD. Проводилось множественное выравнивание, для обнаружения различий в сиквенсах и на основании этого формировалась консесная последовательность для каждого вида. Мы использовали универсальные праймеры для насекомых COIuF и COIuR (Archana M. et al. 2015). Далее были подобраны ферменты рестрикции. В программе Unipro Ugene был выполнен анализ рестрикции in silico для выбранных объектов для более 50 различных рестриктаз. В результате были отобраны следующие рестриктазы - Alwl и HinfI. При такой обработке ампликонов двумя различными рестриктазам можно идентифицировать выбранные виды насекомых. 7. Выделение нуклеиновых кислот проанализированных видов ДНК было выделено на спин-колонках, набор для выделения ДНК из животных тканей (diaGene) согласно инструкции производителя для следующих объектов - Lasius niger, Galleria mellonella, Forficula tomis, Tribolium madens, Vespula germanica. За отчетный период было выделено 96 образцов ДНК. Для выделения ДНК из крупных насекомых (вес одной особи более 100 мг) отбирали грудной отдел. Более мелкие насекомые, личинки и куколки (от 100 – 10 мг) выделялись полностью. В некоторых случаях, при очень маленьких размерах объектов (менее 10 мг) допускалось пулирование по 5 штук. Качество выделенной ДНК оценивали спектрофотометрически на приборе Nano-300 (Allsheng, Китай) по соотношению оптической плотности при длине волн 260/280 нм (отношение значений поглощения 1.9-2.1). В среднем для образцов концентрация составляла от 50 до 150 нг/мкл, отношение значений поглощения А260/280 = 1.88, А260\230= 1.92. Проверку специфичности праймеров проводили при помощи градиентной ПЦР используя смесь 5X qPCRmix-HS (Evrogen, Россия) на амплификаторе Gene Explorer (Bioper, Китай). Для большинства происследованных видов оптимальная температура отжига составляет 51-53℃. Результаты ПЦР визуализировали при помощи электрофореза в 1,5% агарозном геле.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В ходе работы над проектом впервые в составе членистоногих-симбионтов пчелиных ульев Западной Сибири отмечено 5 видов членистоногих из двух отрядов: ложноскорпион (Pseudoscorpiones indet.), жуки Antherophagus pallens, Olibrus sp., Orthoperus sp., Ptinus raptor (Coleoptera). Получен итоговый список видов, включающий 63 вида и таксона более высокого ранга членистоногих из трех классов (Arachnida, Insecta, Collembola). Обработаны и проанализированы количественные данные результатов исследования симбионтов пчелиных ульев 2024 г. Выделены экологические категории симбионтов на основании характера связи видов с медоносными пчёлами и степени их влияния на функционирование пчелиных семей. Из выявленных видов определены объекты для молекулярной диагностики: Vespula germanica, Vespula vulgaris, Galleria mellonella, Tribolium madens, Forficula tomis, Oryzaephilus surinamensis, Lasius niger, Dermestes lardarius, Omosita colon, Achroia grisella. Рестрикционный профиль для самих пчел Apis mellifera, также был подобран и использован в качестве контроля против профиля рестрикции симбионтов. В результате компьютерного моделирования были получены референсные последовательности для каждого вида, и из более чем 50 рестриктаз было отобрано две: AclWi и BstX2I. Для разработки метода были использованы нуклеотидные последовательности фрагмента гена COI из базы данных NCBI и эталонных последовательностей из базы данных BOLD. Для валидации разработанного метода ПЦР-ПДРФ для симбионтов пчел, было проведено секвенирование по Сэнгеру. Полученные профили рестрикции для каждого образца были сопоставлены с результатами прямого секвенирования. Совпадение между предсказанными (in silico) и экспериментальными рестрикционными профилями подтвердило точность метода. Помимо верификации, полученные сиквенсные данные представляют самостоятельную ценность для филогенетического анализа. В результате проведенного исследования был апробирован метод ПЦР-ПДРФ для первичной молекулярной видовой дифференциации десяти видов насекомых-симбионтов, а также для самих пчёл