Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В рамках первого года выполнения Проекта с использованием сконструированных плазмидах для сверхпродукции рекомбинантных белков наружной мембраны энтеробактерий были получены шесть белков в препаративных количествах для дальнейшей работы с использованием аффинной хроматографии, а именно: OmpA, OmpC и OmpF Salmonella enteritidis и Escherichia coli. Далее эти белки были использованы для получения фибриллярных агрегатов in vitro. Было показано, что все шесть белков in vitro образуют крупные неразветвленные фибриллы, имеющие видимую исчерченность. Полученные амилоидные агрегаты также были проверены на SDS-PAGE (электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли) с последующим переносом на мембрану PVDF и вестерн-блот гибридизацией с использованием специфических антител для каждого белка. Для выполнения задачи с белками с сигнальным пептидом нами были выбраны белки OmpA E. coli и S. eneritidis. Правильность конструирования была подтверждена при помощи секвенирования в ЦКП «Геномные технологии, протеомика и клеточная биология» ФГБНУ ВНИИСХМ. Таким образом были получены плазмиды: aLic_OmpA_sig_Ecoli, aLic_OmpA_ sig_Sal. С использованием полученных плазмид были изучены эффекты взаимодействия с амилоид-специфичным красителем Конго красным (КК). Для этого были получены трансформанты штамма E. coli BL21(DE3) с использованием сконструированных плазмид. Трансформированные клетки с растворимым белком Sup35M, а также клетки с пустой плазмидой pFL39 (содержит только ген устойчивости к ампициллину, позволяющий им расти на данной среде) использовали в качестве отрицательного контроля, поскольку они не продуцируют амилоидные фибриллы, что приводит к образованию белых или бледных колоний. Дополнительным контролем служили клетки сверхпродуцирующие соответствующий белок OmpА E. coli или S. enteritidis, но без сигнального пептида, которые показали самые белые колонии, что свидетельствует о том, что белки накапливаются в клетке. Красные колонии (от контакта с КК) с белками с сигнальным пептидом указывают на секрецию амилоидогенных фибрилл. Полученные колонии были дополнительно проверены на наличие двойного лучепреломления в поляризованном свете, которое проводили с использованием насыщенного раствора КК. В обоих случаях на примере OmpА E. coli с и без сигнального пептида мы наблюдали явный конгофильный фенотип колоний: яблочно-зелёное свечение в поляризованном свете и красный цвет клеток в проходящем, - чего не было отмечено для «пустой» плазмиды pFL39. Наконец, полученные трансформированные клетки были исследованы на амилоидные свойства с оценкой их детергентустойчивости и термостабильности возможных агрегатов. Проверку белков OmpA E. coli и S. enteritidis проводили с использованием имеющихся в нашей лаборатории специфических антител. Во всех случаях мы видим существенную долю белков интереса, а также их ди-, три-, тетра- и полимеров (уже на уровне лунок). Для OmpA S. enteritidis с сигнальным пептидом не отмечается полимерная фракция на уровне лунок, что может говорить о меньшей склонности к образованию агрегатов или о наличии специфических агентов, которые могут не подходить, т.к. анализ идёт в гетерологичных для этого белка клетках E. coli, а не нативных S. enteritidis. В целом серия описанных экспериментов продемонстрировала, что полученные in vitro фибриллы шести белков: OmpA, OmpC и OmpF E. coli и S. enteritidis, - проявляют все ключевые характеристики амилоидов, что создает основы для последующего анализа влияния этих белков на агрегацию некоторых из амилоидных белков человека. Полученные фибриллы будут использованы для дальнейших исследований, запланированных на второй год: иммуно-ПЭМ и измерения кругового дихроизма фибрилл белков человека, сидированных агрегатами Omp. Таким образом по результатам первого года выполнения проекта создана основа для дальнейших исследований на пути изучения особенностей амилоидогенеза белков наружной мембраны бактерий семейства Enterobateriaceae. В отчётный период результаты Проекта были представлены в одной публикации в издании, индексируемом в Web of Science/Scopus/РИНЦ, российское издание из Q2 по Scopus: 1. Fayoud H., Belousov, M.V., Antonets, K.S., Nizhnikov, A.A. Pathogenesis-associated bacterial amyloids: the network of interactions // Биохимия / Biochemistry (Moscow), 2024, V.89(12) (Impact Factor WoS 2.8, Q3 / Impact Factor Scopus 0.66, Q2). Публикация прошла все раунды рецензирования и принята в печать в том 89, номер 12 за 2024 год. Данная публикация представляет подробный обзор бактериальных амилоидов, прямо или косвенно участвующих в патогенезе у различных организмов, а также их взаимодействий. В отчётный период результаты Проекта были очно представлены на четырёх конференциях: 1. Белоусов М.В., Косолапова А.О., Фаюд Х., Сулацкий М.И., Сулацкая А.И., Романенко М.Н., Бобылев А.Г., Антонец К.С., Нижников А.А. Порины OmpC и OmpF Salmonella enterica и Escherichia coli обладают амилоидобразующими свойствами // VIII Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (14-19 июня 2024, Саратов, Россия), с. 138. https://ru.congress.vogis.org/abstract-book/ 2. Фаюд Х., Белоусов М.В., Сулацкий М.И., Сулацкая А.И., Нижников А.А. Белок Dps Salmonella enterica subsp. enterica var. Issatschenko формирует фибриллы с амилоидными свойствами // VIII Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (14-19 июня 2024, Саратов, Россия), с. 180. https://ru.congress.vogis.org/abstract-book/ 3. Belousov M.V., Kosolapova A.O., Fayoud H., Sulatsky M.I., Sulatskaya A.I., Romanenko M.N., Bobylev A.G., Antonets K.S., Nizhnikov A.A. Porins OmpC and OmpF of Salmonella enterica and Escherichia coli possess amyloid-forming properties // Prion 2024 Conference Abstracts. Prion, 2024, 18(sup1), 1–47. https://doi.org/10.1080/19336896.2024.2424058 (23-27 Oct 2024, Nanchang, China), p. 13. (Impact Factor WoS 1.9, Q4 / Impact Factor Scopus 0.68, Q2) 4. Belousov M.V., Kosolapova A.O., Fayoud H., Sulatsky M.I., Sulatskaya A.I., Romanenko M.N., Bobylev A.G., Antonets K.S., Nizhnikov A.A. Different outer membrane proteins of Escherichia and Salmonella form polymeric amyloid assemblies // Polymers 2024 - Polymers for a Safe and Sustainable Future (28-31 May 2024, Athens, Greece), p. 122. https://sciforum.net/event/polymers2024 5. Фаюд Х., Белоусов М.В., Антонец К.С., Сулацкий М.И., Сулацкая А.И., Нижников А.А. Амилоидные свойства поринов OmpC и OmpF Escherichia coli и Salmonella enterica in vivo // III Международная конференция «Сохранение и преумножение генетических ресурсов микроорганизмов» (8–10 июля 2024, Санкт-Петербург, Россия), с. 101. https://brc.arriam.ru/requirements/