Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Разработаны комплекты олигонуклеотидов, комплементарных к 10 SNPs, ранее продемонстрировавших ассоциации с молочной продуктивностью крупного рогатого скота по показателям: жир, белок, удой за 305 дней лактации. Для достижения наиболее однозначной аллельной дискриминации при использовании ДНК лигазы Taq проведены эксперименты для определения оптимальных параметров мисмэтчей на олигонуклеотидных зондах. Для биоконъюгации олигонуклеотидов с помощью электрофореза проведена экспериментальная оценка специфичности моно- и бифункциональных молекул-линкеров: азид-флуорофоры в паре с алкин-модифицированными олигонуклеотидами, азид-флуорофоры в паре с глицидилпропаргиловым эфиром, глицидилпропаргиловый эфир в паре с одно- и двухцепочечными молекулами ДНК, а также глицидилпропаргиловый эфир с каждым из четырех дезоксирибонуклеиновых трифосфатов: dCTP, dATP, dGTP, dTTP. На данном этапе отработаны способы наиболее бережной очистки получаемых продуктов из агарозного геля, а также реакционных смесей. Выявлено, что для азид-флуорофоров в паре с алкин-модифицированными олигонуклеотидами не хватает чувствительности гель-документирующих систем для детекции конъюгированных единичным флуорофором продуктов реакции. Для пары азид-флуорофоров с глицидилпропаргиловым эфиром направление движения модифицированного через медную клик-реакцию эфира обратно противоположно направлению движения нуклеиновых кислот. В ходе исследований глицидилпропаргилового эфира в паре с одно- и двухцепочечными молекулами ДНК выявлено, что, вероятно, изучаемая форма эфира, конкретная конформация функциональных групп данной линкерной молекулы, обладает недостаточной реакционной способностью для модификации молекул ДНК. В результате исследований глицидилпропаргилового эфира с каждым из четырех дезоксирибонуклеиновых трифосфатов: dCTP, dATP, dGTP, dTTP было отмечено, что наиболее эффективно в реакцию алкилирования вступают dCTP и dGTP, имеющие наиболее контрастную картину свечения при пластинчатом гель-электрофорезе. Проведены экспериментальные апробации и оптимизация постановки медной клик-реакции между глицидилпропаргиловым эфиром и азидом флуорофора R6G: определены оптимальные соотношения буфера, содержащего медь, концентрации аскорбиновой кислоты, основных субстратов реакции (алкинов и азида флуорофора). Проведены эксперименты по градиенту температур для получения наибольшего выхода продукта реакции и для поиска наиболее щадящих условий конъюгирования двухцепочечных молекул ДНК с глицидилпропаргиловым эфиром. Установлено, что Taq-полимераза не подходит для экспериментов с использованием коммерчески доступной модификации деокситидин-5'-трифосфата – FAM-dCTP. Дальнейшие эксперименты по амплификации с модифицированными коммерчески доступными трифосфатами будут проведены с помощью фрагмента Клёнова. Разработан протокол для клик-реакции между алкин-модифицированными олигонуклеотидами и азидом с флуорофором (компонента с азид-функциональной группой в реакционной смеси в разы больше, чем компонента с алкиновой группой). Для проведения генетических ассоциативных исследований проведен сравнительный анализ 6 популяций крупного рогатого скота (n=443) по показателям продуктивности (жир, белок, удой за 305 дней лактации). Таким образом, на данном отчетном этапе проекта проведена апробация и оптимизация протокола медной клик-реакции, выполнены исследования по оценке эффективности алкилирующего ДНК агента (глицидилпропаргиловый эфир), проведена разработка комплектов олигонуклеотидов для лигазной реакции генотипирования образцов ДНК крупного рогатого скота, отработана процедура последовательного протекания лигазной и медной клик-реакции; охарактеризованы возможные способы усиления сигнала детекции продуктов лигазной реакции. Таким образом, проведено последовательное сочетание лигазной реакции и реакции биоконъюгирования флуорофоров с использованием клик-реакции. Проведен сравнительный анализ по показателям молочной продуктивности 6 популяций крупного рогатого скота в соответствии с заявленным планом работ на отчетный период. Подготовлена и написана 1 публикация, результаты работы представлены в виде докладов на Международной и Всероссийской научно-практических конференциях. Проведен мастер-класс для студентов-практикантов по постановке и оценке эффективности медной клик-реакции.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Был успешно синтезирован и охарактеризован новый линкер для биоконъюгации – 1,3,5-тринитро-2-(проп-2-ин-1-илокси)бензол (соединение № 2). Метод УФ-спектроскопии подтвердил его фотофизические свойства, выявив единственную полосу поглощения при 257 нм, что характерно для π-π* переходов в нитроароматических системах. Для проведения экспериментальных исследований по определению эффективности модификации трифосфатов, а также их встраивания при ПЦР необходимо отсутствие поглощения в спектрах наиболее часто используемых в ПЦР (совместимых с оборудованием в молекулярно-биологических лабораториях) флуоресцентных красителей. Выявлено отсутствие поглощения в видимом спектре, что делает данный линкер совместимым с широким спектром стандартных флуоресцентных красителей, таких как ROX, TAMRA, BDP, R6G и FAM, используемых в молекулярной биологии. При доказательстве совместимости изучаемого линкера с флуорофорами по спектроскопическим характеристикам возможно проведение дальнейших исследований его использования в биоконъюгации с dNTP и ДНК. Была экспериментально доказана возможность нековалентной биоконъюгации этого линкера с нуклеиновыми кислотами. Таким образом, в результате серии экспериментов по модификации трифосфатов было установлено, что наиболее эффективными субстратами являются dATP и dCTP, которые демонстрируют наиболее яркую флуоресценцию после конъюгации и клик-реакции с красителем азид-R6G. Вторым направлением в изучении эффективности конъюгации и поиска оптимального протокола для исследуемого соединения являются эксперименты с двухцепочечной ДНК. Для ПЦР-продуктов (ампликонов) была подтверждена эффективность модификации, о чем свидетельствовало увеличение молекулярной массы продукта в 2,5–3,5 раза по данным гель-электрофореза. В ходе оптимизации протокола были определены оптимальные концентрации линкера, а именно его разведение в ДМСО в соотношениях 1:5 и 1:10. Критическим этапом проекта стало исследование возможности встраивания модифицированных нуклеотидов в ДНК с помощью полимераз. Было установлено, что классическая Hot Start Taq-полимераза не способна эффективно встраивать модифицированные dATP и dCTP. Однако выявлено, что фрагмент Клёнова обладает такой способностью, хотя эффективность процесса и равномерность модификации конечного продукта оказались недостаточно высокими, что указывает на необходимость проведения дальнейших исследований в данном направлении. Были получены новые данные в ходе проведения ассоциативных тестов. По результатам генотипирования по тринадцати SNP-маркерам и ассоциативного анализа были выявлены значимые связи с параметрами молочной продуктивности. В частности, для тагильской породы рекомендуется отрицательный отбор по аллелю G* полиморфизма rs110347054 и положительный отбор по аллелю T* (rs41567027). Для истобенской породы рекомендуется положительный отбор по аллелю C* (rs109529386). Также была дана сравнительная характеристика продуктивности пород, подтвердившая высокую жирномолочность тагильской и сычевской пород и высокое содержание белка в молоке у истобенской породы. Завершающим направлением работ в данном проекте является разработка и оптимизация тест-системы для генотипирования крупного рогатого скота с использованием лигазной реакции с одноцепочечными зондами. На основе разработанного метода модификации ДНК с помощью нового линкера была усовершенствована система генотипирования на основе лигазной реакции. Показано, что модификация одноцепочечных продуктов лигазной реакции 1,3,5-тринитро-2-(проп-2-ин-1-илокси)бензол позволяет достичь их лучшего разделения. Однако выявлено ограничение метода: стохастический характер модификации не позволяет достоверно разделять продукты с разницей в несколько нуклеотидов, это ограничение может являться направлением для будущих исследований. Результаты работ были оформлены в виде двух публикаций в журналах 1 квартиля в Белом списке: Генетика и Журнал органической химии, переводные версии которых индексируются в международных базах данных Web of Science и Scopus.