Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В ходе выполнения работ по проекту в 2024 г. был проведен детальный анализ развития семязачатка и женского гаметофита у двух видов пионов Paeonia anomala и P. lactiflora для выявления факторов реализации потенций клеток спорогенного комплекса и развития нескольких зародышевых мешков. Развитие нескольких зародышевых мешков у исследованных видов пионов, связано с формированием многоклеточного спорогенного комплекса, который состоит из 12-18 клеток у P. anomala и 20-24 - у P. lactiflora. Дифференциация мегаспороцитов происходит неодновременно, преимущественное развитие получают мегаспороциты, расположенные в халазальной части спорогенного комплекса. В мейоз могут вступать от 1 до 4 мегаспороцитов, у которых формируется каллозная оболочка. Наиболее часто образуются 2-3 тетрады мегаспор у P. anomala и 1-2 - у P. lactiflora. Дальнейшее развитие происходит обычно в одной тетраде, однако остальные могут сохраняться в интактном состоянии до позднего 4-ядерного зародышевого мешка. В редких случаях в семязачатке возможно развитие двух гаметофитов до зрелого состояния. Причинами развития единственного зародышевого мешка предположительно могут быть: конкуренция между тетрадами, нарушения в мейозе, механизмы, регулирующие судьбу клеток и программу их развития. Выявлены некоторые морфогенетические корреляции в развитии зародышевого мешка и окружающих структур семязачатка. В частности, показано, что развитие двух зародышевых мешков на поздней 4-ядерной стадии приводит к частичной или полной деструкции нуцеллярного колпачка, тогда как при развитии одного гаметофита он долго сохраняется. Впервые показана динамика крахмала в тканях нуцеллуса в период развития гаметофита у пионов: его накопление сперва в клетках базальной части, где происходит формирование тетрад и 2-ядерного зародышевого мешка, а затем наибольшая концентрация в латеральных частях париетальной ткани, окружающих растущий гаметофит. Впервые для пионов проведен анализ ультраструктурной организации клеток семязачатка в период от инициации интегументов до завершения мегаспорогенеза, в результате которого выявлены специфичные черты спорогенных клеток, отличающие их от окружающих клеток нуцеллуса. Показано, что период инициации они имеют плотную цитоплазму без вакуолей, недифференцированные митохондрии и пластиды без выраженных крист и тиллакоидов, что свидетельствует о меристематичности этих клеток. Окружающие клетки нуцеллуса, наоборот, проявляют большую степень дифференциации, связанную с появлением вакуолей в цитоплазме, развитием крист в митохондриях и образованием крахмала в пластидах. Все клетки семязачатка, включая спорогенные, на этой стадии связаны друг с другом многочисленными плазмодесмами. К началу мейоза клетки спорогенного комплекса начинают различаться между собой. В мегаспороцитах, расположенных в микропилярной части, пластиды начинают накапливать крахмал, митохондрии увеличиваются в размерах и формируют сеть крист, в клеточных стенках с микропилярного полюса сохраняются плазмодесмы, обеспечивающие связь с париетальной тканью. У мегаспороцитов, занимающих халазальную часть комплекса, наоборот, органеллы остаются слабо дифференцированными, в цитоплазме накапливается большое количество рибосом, структуры Гольджи-аппарата производят много везикул с полисахаридным содержимым, плазмодесмы в этих клетках отсутствуют, а с микропилярного полюса начинает формироваться каллозная оболочка. Получены новые данные по ультраструктурным особенностям образования каллозного слоя в мегаспороцитах. Показано участие многочисленных везикул, образованных структурами Гольджи-аппарата, в формировании между плазмалеммой и клеточной стенкой электронно-прозрачного слоя, в котором происходит образование каллозы, откладывающейся плотным слоем вблизи клеточной стенки. По мере дифференциации мегаспороцита и подготовки его к мейозу слой каллозы утолщается, особенно в микропилярной части клетки. Проведен обзор литературы по мегаспорогенезу и инициации развития женского гаметофита. Рассмотрены механизмы дифференциации спорогенной клетки и ее подготовки к мейозу, к которым относятся: генетический, эпигенетический, физиологический и позиционный контроль, цитологические изменения, связанные с перестройкой хроматина в ядре, распределение органелл в цитоплазме, изменение состава клеточной стенки. Показано значение каллозы как молекулярного фильтра для селективного сигналинга, контролирующего развитие мегаспороцитов. Обсуждены изменения в ультраструктурной организации мегаспороцита во время мейоза, показана роль полярного распределения органелл в делении и в выборе функциональной мегаспоры. Данный обзор позволит в дальнейшей работе лучше разобраться в процессах происходящих в семязачатке пионов и выявить факторы, определяющие развитие нескольких мегаспороцитов, а также причины их гибели в процессе развития, приводящие к дегенерации как гаметофита, так и семязачатка в целом.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В ходе выполнения работ по проекту в 2025 г. было продолжено изучение закономерностей развития семязачатка и женского гаметофита у двух видов пионов Paeonia anomala и P. lactiflora с целью выявления факторов для реализации потенций клеток спорогенного комплекса, развития нескольких зародышевых мешков и формирования полиэмбрионных семян. Продолжен анализ особенностей ультраструктуры клеток спорогенного комплекса у P. lactiflora. Уточнена характеристика мегаспороцитов и выявлена различная их дифференциация в зависимости от расположения в спорогенном комплексе. Мегаспороциты, расположенные в микропилярной части спорогенного комплекса, сохраняют единичные плазмодесмы, связывающие их с париетальной тканью, имеют более зрелые органеллы, равномерно распределенные по всей цитоплазме, и, по-видимому специализируются по типу окружающих нуцеллярных клеток. Напротив, халазальные мегаспороциты отличаются интенсивным ростом в длину, выраженной полярностью, изоляцией от других клеток за счет закупорки плазмодесм. В одном из таких мегаспороцитов начинается отложение каллозы на клеточной стенке, особенно выраженное на микропилярном полюсе, что свидетельствует о подготовке к мейозу. Выявлены некоторые закономерности образования каллозного слоя на клеточной стенке мегаспороцита перед мейозом связанные с активностью множества диктиосом, концентрирующихся на микропилярном полюсе мегаспороцита, и продуцирующих везикулы с микрофибриллами, вероятно, полисахаридной природы. По-видимому, за счет слияния этих везикул образуется электронно-прозрачный слой между клеточной стенкой и цитоплазмой и за счет которого происходит образование каллозы. Дана ультраструктурная характеристика клеток в образующейся после мейоза тетраде мегаспор, показаны особенности халазальной клетки, являющейся функциональной (крупные размеры, много митохондрий с многочисленными кристами, пластид с неразвитыми тиллакоидами и без крахмала, ЭПР и небольших вакуолей в цитоплазме, центральное положение ядра), отличающие ее от остальных мегаспор. Выявлена ранняя дегенерация микропилярной мегаспоры (сразу после завершения мейоза), что, вероятно, обусловлено сохранением толстого каллозного слоя вокруг этой клетки. Проанализирована локализация кальция в мегаспороцитах и мегаспорах, образуемых после мейоза у P. lactiflora; показано незначительное количество кальция в микропилярных и халазальных мегаспороцитах перед мейозом и значительное увеличение его концентрации в мегаспорах после мейоза, особенно в халазальной, что предполагает участие кальция в развитии халазальной мегаспоры в зародышевый мешок. Сравнительные анализ развития семязачатка и зародышевого мешка у растений P. lactiflora, выращенных в условиях интродукции (Санкт-Петербург) и в естественных местах обитания (Забайкальский край) не выявил каких-либо значимых отличий. Однако, установлено, что материале, собранном в Забайкальском крае образования дополнительных гаметофитов не наблюдалось ни на одной из стадий, тогда как в условиях интродукции растения формировали на ранних стадиях по два зародышевых мешка в семязачатках в 38% случаев, хотя к стадии сформированного зародышевого мекша этот процент снижался до 4. Возможно, развитие дополнительных гаметофитов у растений в интродукции связано с изменением каких-либо внутренних факторов (физиологических, генетических и др.), приводящих к дисбалансу в системе репродукции, о чем упоминали и другие исследователи (Walters, 1962; Яковлев, Иоффе, 1965; Шамров, 1997; Chen et al., 2022). О возможных нарушениях в системе репродукции также свидетельствует низкая семенная продуктивность (37%), в естественных условиях практически все семязачатки развиваются в семена. Исследование процесса оплодотворения у исследованных видов Paeonia показало значительное их сходство. Прослежены основные этапы прогамной фазы и показано изменение структуры спермиев в этот период: от удлиненно-овальных с рыхлым хроматином (в пыльцевой трубке во время ее роста и вхождения в зародышевый мешок) до округлых с плотным хроматином (в период освобождения спермиев из пыльцевой трубки в синергиде и расхождения их к женским половым клеткам – яйцеклетке и центральной клетке). Подтвержден премитотический тип сингамии. Получены новые данные об участии спермиев одной или разных пыльцевых трубок в оплодотворении женских половых клеток нескольких гаметофитов, развивающихся в семязачатках P. anomala (у P. lactiflora при исследовании процесса оплодотворения семязачатков с двумя зародышевыми мешками не наблюдалось). Установлено, что спермии в первую очередь сливаются с яйцеклетками обоих зародышевых мешков, затем с центральными клетками. Поэтому при вхождении в такие семязачатки единственной пыльцевой трубки тройного слияния не происходит ни в одном из зародышевых мешков, а в отсутствии эндосперма зародыши в семени на развиваются, что может отрицательно влиять на репродуктивный успех. Развитие полноценных семян на базе семязачатков с двумя гаметофитами происходит при вхождении более одной пыльцевой трубки.