Выяснение механизмов патологической трансформации амилоидогенных белков: поиск профилактических подходов.

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 24-44-20003

НазваниеВыяснение механизмов патологической трансформации амилоидогенных белков: поиск профилактических подходов.

Руководитель Муронец Владимир Израилевич, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова» , г Москва

Конкурс №94 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований международными научными коллективами» (INSF)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые слова Нейродегенеративные заболевания,болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, амилоидные белки, альфа-синуклеин, прионный белок, альфаВ-кристаллин,тау-белок, бета-амилоидный пептид, амилоидная трансформация, белок-белковые взаимодействия, полипептиды, коронавирусная инфекция, S(Спайк)-белок, N (нуклеокапсидный)-белок

Код ГРНТИ31.27.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Поиск новых механизмов, участвующих в возникновении и развитии амилоидных нейродегенеративных заболеваний, таких как болезни Альцгеймера и Паркинсона, сохраняет свою актуальность, поскольку несмотря на огромное количество работ в этой области до сих пор не удается найти эффективные способы их лечения. Отсутствуют также методы ранней диагностики и профилактики этих болезней. На наш взгляд, одной из причин такой ситуации является недостаточное внимание к роли белок-белковых взаимодействий между амилоидогенными белками и различными белками-партнерами в формировании патологических белковых агрегатов. Амилоидогенные белки, такие как альфа-синуклеин, тау-белкок, прионный белок и бета-амилоидный пептид, относятся к так называемым «естественно-развернутым белкам», которые склонны не только к формированию амилоидных структур, но и взаимодействию с различными белками. Такое взаимодействие, с одной стороны, может как стимулировать, так и предотвращать образование олигомерных или фибриллярных амилоидов, а с другой, не позволять белкам-партнерам осуществлять их функции в обеспечении жизнедеятельности клеток. Последний аспект практически не изучен за исключением работ о блокировании системы шаперонов амилодогенными белками. В предлагаемом проекте основное внимание будет уделено взаимодействию между разными амилоидогенными белками - альфа-синуклеином, тау-белком, прионным белком и бета-амилоидным пептидом. Все белки присутствуют в нервных тканях здоровых людей, и их взаимодействие друг с другом должно быть частью как возникновения, так и прогрессии амилоидогенных нейродегенеративных заболеваний. Изучение влияния амилоидогенных белков на патологическую трансформацию друг друга не только позволит обнаружить новые механизмы развития нейродегенеративных заболеваний, но и предложить новые подходы к их профилактике и лечению. Неэффективность использования низкомолекулярных соединений для предотвращения олигомеризации и фибриллизации амилоидогенных белков показывает, что более перспективно использовать полипептиды или белки, влияющие на патологическую трансформацию амилоидов за счет белок-белковых взаимодействий. Прежде всего, нами будут использованы фрагменты прионного белка (N-концевой и С-концевой домены) для предотвращения амилоидной агрегации альфа-синуклеина и бета-амилоидного пептида. Совместно с иранскими коллегами будет изучено влияние патологических мутаций в альфа-синуклеине на его взаимодействие с полноразмерным прионным белком, а также на эффективность предотвращения трансформации альфа-синуклеина фрагментами прионного белка. Перспективным белком-партнером, взаимодействие с которым может предотвращать формирование амилоидных структур альфа-синуклеина, является малый белок теплового шока αВ-кристаллин. Мутации в этом белке не только приводят к патологическим процессам в органах зрения, сердечных и скелетных мышцах, но и вызывают нарушения в нервных тканях. Совместное с иранскими партнерами изучение влияния мутаций в αВ-кристаллине и амилоидогенных белках на их связывание друг с другом и на амилоидогенные процессы позволит найти новые механизмы возникновения болезни Паркинсона и, в перспективе, использовать αВ-кристаллин или его фрагменты для лечения этого заболевания. Третий аспект проекта также касается участия белков-партнеров амилоидогенных белков в развитии нейродегенеративных заболеваний и связан с выяснением роли короновирусной инфекции в этом процессе. Будет изучено как влияют белки коронавируса COVID–19 (спайк- и нуклеокапсидный белки) на амилоидную трансформацию альфа-синуклеина в системе с изолированными белками, а также на клетках, продуцирующих альфа-синуклеин. Это позволит выяснить роль как коронавирусной инфекции в нейродегенеративных процессах, так и воздействия на них вакцин от COVID-19 разного типа.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Целью совместного с Тегеранским университетом проекта является выяснение новых механизмов возникновения и развития нейродегенеративных заболеваний амилоидной природы, а именно болезней Альцгеймера и Паркинсона, а также прионных патологий. Кроме того, при реализации проекта предполагается найти подходы к предотвращению патологической трансформации амилоидогенных белков, прежде всего с помощью альфаВ-кристаллина, обладающего шапероно-подобными функциями. Для достижения поставленных целей на первой стадии выполнения проекта обеими группами участников были разработаны оригинальные способы получения необходимых белков, а именно, альфаВ-кристаллина, альфа-синуклеина, бета-амилоидного пептида 1-42, тау-белка и прионного белка. Кроме того, иранскими партнерами было получено 6 мутантных форм альфаВ-кристаллина, а российскими мутантная форма альфа-синуклеина А53Т без каких-либо дополнительных мотивов в его структуре. Был также проведен обмен полученными белками и плазмидами, необходимыми для их получения, между российскими и иранскими участниками проекта. Выделенные белки и их мутантные формы были охарактеризованы с помощью различных физико-химических методов, что позволило продемонстрировать сохранение ими структурных особенностей и функциональной активности, а также выявить последствия введения мутаций, как в альфа-синуклеин, так и в альфаВ-кристалаллин. Иранскими партнерами были получены данные о влиянии введения мутаций в альфаB-кристаллин на его свойства. В частности, на изменения параметров собственной флуоресценции и оптических характеристик, а также термодинамических параметров методом дифференциальной сканирующей калориметрии. Обнаружено, что введение мутаций существенно изменяет конформацию альфаВ-кристаллина, хотя и не препятствует формированию его олигомерных форм, характерных для белка дикого типа. Последнее наблюдение было подтверждено российскими партнерами с помощью метода динамического рассеяния света. Высказано предположение, что сохранившие олигомерное состояние мутантные формы альфа-кристаллина будут эффективно подавлять патологическую трансформацию амилоидогенных белков. Российскими партнерами было выявлено взаимодействие между двумя белками - актином и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой, принимающими участие в развитии нейродегенеративных заболеваний, в частности болезни Альцгеймера. Было обнаружено, что при связывании S-нитрозилированной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы с актином протекает реакция транснитрозилирования, приводящая к переносу NO-группы от фермента на С-концевой остаток цистеина Cys374 актина. Имеющаяся информация о роли актина в развитии нейродегенеративных патологий показывает, что актин и его комплексы с глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой могут быть новыми мишенями при разработке лекарственных средств против амилоидных заболеваний. Для выяснения особенностей взаимодействия прионного белка PrP с белками-партнерами, а также роли отдельных участков этого белка в формировании амилоидных структур были выделены и охарактеризованы N- и С-концевых фрагменты PrP. Выделенный структурированный С-концевой фрагмент прионного белка в целом сохранял вторичную структуру, характерную для полноразмерного PrP, и обладал способностью формировать амилоидные структуры. При этом размер амилоидных агрегатов был существенно меньше, чем размер фибрилл, образованных полноразмерным PrP. Неструктурированный N-концевой фрагмент PrP не только не формировал амилоидных агрегатов, а, напротив, препятствовал фибриллизации полноразмерного PrP. Разное воздействие N-концевой фрагмент PrP оказывал на патологическую трансформацию других амилоидных белков. Так, амилоидная трансформация бета-амилоидного пептида 1-42 предотвращалась N-концевым фрагментом PrP. Однако, в отличие от воздействия на бета-амилоидный пептид, N-концевой фрагмент PrP стимулировал амилоидную трансформацию альфа-синуклеина дикого типа и его мутантной формы А53Т. В обоих случаях в присутствии N-концевого фрагмента PrP существенно уменьшалась лаг-фаза появления амилоидных структур. Таким образом, было показано, что два фрагмента PrP могут оказывать влияние как на агрегацию исходного полноразмерного PrP, так и на трансформацию других амилоидогенных белков, причем характер воздействия зависит от свойств конкретного белка. Возможно, N-концевой фрагмент PrP может быть использован для предотвращения патологической трансформации бета-амилоидных пептидов и самого прионного белка. С целью выяснения возможной взаимосвязи коронавирусной инфекции, а также вакцинации против этого заболевания, и развития нейродегенеративных болезней, в частности болезни Паркинсона, было изучено взаимодействие вирусных белков и альфа-синуклеина. Для этого был выделен и охарактеризован RBD-фрагмент спайк-белка коронавируса SARS-CoV-2, экспрессированный в эукариотической системе. Было продемонстрировано взаимодействие RBD-фрагмента спайк-белка и N-белка SARS-CoV-2 с альфа-синуклеином с помощью иммуноферментного анализа. Было показано также, что RBD-фрагмент спайк-белка может предотвращать амилоидную трансформацию мутантной формы альфа-синуклеина А53Т, увеличивая лаг-фазу фибриллизации и снижая выход амилоидных форм. При этом N-белок, напротив, значительно стимулировал амилоидоизацию альфа-синуклеина А53Т. Сделанные наблюдения указывают на то, что возникновение нейродегенеративных процессов амилоидной природы более вероятны при вакцинации против SARS-CoV-2 препаратами, содержащими N-белок. Для дальнейшего анализа описанных процессов были получены клеточные линии нейробластомы SH-SY5Y, стабильно экспрессирующих человеческий альфа-синуклеин дикого типа, а также мутантную форму альфа-синуклеина А53Т (3 клона), которые будут использованы для одновременной экспрессии в клетках альфа-синуклеина и белков коронавируса. Участниками проекта было проведено 2 совместных семинара (один виртуальный и один очный) и организован визит руководителя иранского проекта профессора Резы Юсефи в Москву. Российская лаборатория участвовала в акции РНФ «День без турникетов». По результатам проведенной работы было опубликовано 2 статьи - одна экспериментальная и одна обзорная в журнале первого квартиля (обе в журнале «Archives of Biochemistry and Biophysics», из-во «Elsevier»). Одна обзорная статья принята в печать в отечественный журнал «Успехи биологической химии» («Biochemistry» (Moscow)) второго квартиля и будет опубликована в феврале 2025 года. Готовятся к публикации несколько совместных с иранскими коллегами статей. Результаты работы были представлены на двух конференциях («Биохимия человека 2024» и «VI Международная конференция Постгеном'2024. XI Российский симпозиум Белки и пептиды. Российско-Китайский конгресс») в виде 3 устных докладов.

Публикации

1. В. И. МУРОНЕЦ, С. С. КУДРЯВЦЕВА, Л. П. КУРОЧКИНА, Е. В. ЛЕЙСИ, Ю .Ю. СТРОЙЛОВА, Е. В. ШМАЛЬГАУЗЕН ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ПАТОЛОГИЧЕСКУЮ ТРАНСФОРМАЦИЮ АМИЛОИДНЫХ БЕЛКОВ: ОТ ПОСТТРАНСЛЯЦИОНННЫХ МОДИФИКАЦИЙ ДО ШАПЕРОНОВ Успехи биологической химии, Biochemistry (Moscow), Special issue. BIOLOGICAL CHEMISTRY REVIEWS, т. 65, с. 237–280 (год публикации - 2025)
10.1134/S0006297924604003

2. Муронец В.И. ВЛИЯНИЕ ПОСТТРАНСЛЯЦИОНННЫХ МОДИФИКАЦИЙ И ШАПЕРОНОВ НА ВОЗНИКНОВЕНИЕ АМИЛОИДНЫХ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Материалы Всероссийской Конференции с международным участием : "Биохимия человека 2024", Издательство Е-ното, Москва, 2024, ББК 28.707.2я43, Б63 , Материалы Всероссийской Конференции с международным участием : "Биохимия человека 2024", 17-19 октября,2024, РУДН, МОСКВА, М.: Е-ното, 2024, 448с., стр.70 (год публикации - 2024)

3. Муронец В.И., Медведева М.В., Шмальгаузен Е.В. S-НИТРОЗИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ: МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ И УЧАСТИЕ В ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ Сборник тезисов докладов VI Международная конференция ПОСТГЕНОМ’2024, XI Российский симпозиум БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ, Russian–Chinese LIFE SCIENCES CONGRESS 29 октября – 2 ноября 2024, Сборник тезисов докладов VI Международная конференция ПОСТГЕНОМ’2024, XI Российский симпозиум БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ, Russian–Chinese LIFE SCIENCES CONGRESS стр. 304 (год публикации - 2024)

4. Шмальгаузен Е.В., Медведева М.В., Муронец В.И. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is involved in the pathogenesis of Alzheimer's disease Archives of Biochemistry and Biophysics, V. 758, P. 110065 (1-8). Epub 2024 Jun 19. (год публикации - 2024)
10.1016/j.abb.2024.110065.

5. Медведева М.В., Серебрякова М.В., Матюшенко А.М., Нефедова В.В., Муронец В.И., Шмальгаузен Е.В. Binding of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase to G-actin promotes the transnitrosylation reaction Archives of biochemistry and biophysics, V. 762, P.110189 (pp. 1-11) (год публикации - 2024)
10.1016/j.abb.2024.110189

6. Кудрявцева С.С., Уразов Д.О., Муронец В.И. Влияние амилоидогенных белков и их фрагментов на патологическую трансформацию друг друга Материалы Всероссийской Конференции с международным участием : "Биохимия человека 2024", Издательство Е-ното, Москва, 2024, ББК 28.707.2я43 Б63, Материалы Всероссийской Конференции с международным участием : "Биохимия человека 2024", 17-19 октября,2024, РУДН, МОСКВА, М.: Е-ното, 2024, 448с., стр.64 (год публикации - 2024)

7. Кудрявцева С.С., Стройлова Ю.Ю., Смольская С.А., Лейси Е.В., Баринова К.В., Муронец В.И Exploring the impact of prion protein N- and C-terminal fragments on the pathological transformation of alpha-synuclein Biochimie, Oct 8:S0300-9084(25)00228-7. (год публикации - 2025)
https:/10.1016/j.biochi.2025.10.004

8. Гаффари А.Р., Мирзаи З., Шахсавани М.Б., Соми Л.Р., Стройлова Ю.Ю., Баринова К.В., Аманлоу М., Муронец В.И., Хабиби-Резаи М., Сабури А.А., Мусави-Мовахеди А.А., Юсефи Р. The p.K90N mutation in human HSPB5 highlights the critical role of lysine 90 in chaperone function and structural integrity. Archives of biochemistry and biophysics, 769:110424 (год публикации - 2025)
10.1016/j.abb.2025.110424

9. Салехи А., Бахрами З., Шахсавани М.Б., Соми Л.Р., Стройлова Ю.Ю., Зарей И., Аманлоу М., Хеммати М., Муронец В.И., Сабури А.А., Мусави-Мовахеди А.А., Юсефи Р. Structural characterization and functional analysis of human αB-crystallin with the p.R11G mutation: Insights into cataractogenesis and cardiomyopathy. International journal of biological macromolecules, 307(Pt 3):141895 (год публикации - 2025)
10.1016/j.ijbiomac.2025.141895

10. Константинова А.В., Поздышев Д.В., Сорокина С.А., Шифрина З.Б., Муронец В.И., Стройлова Ю.Ю Образование композитных структур пиридилфениленовыми дендримерами с альфа-синуклеином ИНЭОС OPEN, io023325 (год публикации - 2025)
10.32931/io2602a

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
αB-Кристаллин (αBC) дикого типа и его мутантные формы, включая формы, связанные с рядом патологических нарушений, оказывают выраженное воздействие на амилоидную трансформацию альфа-синуклеина. При этом эффекты ярко проявляются при изучении амилоидоизации мутантного альфа-синуклеина A53T, вызывающего раннюю аутосомно-доминантную болезнь Паркинсона. Хотя все формы αBC эффективно подавляют стадию нуклеации альфа-синуклеина, что выражается в существенном увеличении лаг-фазы амилоидной трансформации, их влияние достаточно специфично. Так мутантная форма R56Q демонстрирует наиболее выраженный антиамилоидный эффект, практически полностью предотвращая фибриллизацию как мутантного альфа-синуклеина A53T, так и белка дикого типа. Однако мутантные формы R163C и K90N проявляет двойственный эффект, существенно увеличивая лаг-фазу, но стимулируя последующий процесс фибриллизации. Было показано также, что αBC дикого типа препятствует образованию нерастворимых в детергенте форм альфа-синуклеина при совместной продукции двух белков в культуре клеток HEK293T, и, следовательно, может оказывать благоприятное воздействие при возникновении синуклеинопатий. Мы полагаем, что мутантная форма αBC R56Q представляет наибольший интерес для дальнейшего изучения в качестве потенциального терапевтического агента для лечения нейродегенеративных заболеваний. Сведения о структурных основах особенностей функционирования двух мутантных форм αBC ( K90N и R11G), а также гипотезы о возможной роли данных мутаций в развитии ряда патологических процессов, включая нейродегенерацию, были опубликованы в двух совместных статьях с иранскими коллегами: Ghaffari et al.. Arch.Biochem.Biophys. 2025,769:110424; Salehi et al., Int.J.Biol.Macromol. 2025, 307(3):141895 Для выяснения возможной роли протеолитического расщепления прионного белка (PrP) в развитии прионных заболеваний и других нейродегенеративных процессов были выделены рекомбинантные полноразмерный PrP и его С- и N-концевые фрагменты. Было показано, что протеолитическое расщепления PrP in vivo, вероятно, не оказывает неблагоприятного воздействия на возникновение прионных заболеваний, поскольку оба фрагмента предотвращают патологическую трансформацию полноразмерного PrP. При этом полноразмерный PrP и его N-концевой фрагмент при добавлении к альфа-синуклеину стимулируют агрегацию этого белка и появление бета-амилоидных структур. Однако такое воздействие не только не приводит к дополнительному формированию полноценных фибриллярных структур, а, напротив, полностью предотвращает их образование. Полученные данные важны для понимания молекулярных механизмов влияния протеолитического расщепления PrP in vivo на развитие прионных заболеваний и синуклеинопатий. Кроме того, перспективным направлением представляется использование N-концевых фрагментов PrP для предотвращения амилоидогенной трансформации полноразмерного PrP, альфа-синуклеина и других амилоидогенных белков. Результаты этой части проекта опубликованы в статье Kudryavtseva et al., Biochimie. 2025,S0300-9084(25)00228-7). Было показано, что при ухудшении шапероноподобной активности у мутантных по остаткам аргинина форм αBC может усиливаться их способность предотвращать амилоидную трансформацию альфа-синуклеина. Это наблюдение требует дальнейшего изучения, в том числе, с помощью введения пост-трансляционных модификаций, а именно гликирования. Образование тройных комплексов между альфаВ-кристаллином, ГАФД и актином указывает на возможность регуляции функционально важного взаимодействия между гликолитическим ферментом и мышечным белком с помощью αBC. При изучении взаимодействия дендримеров с альфа-синуклеином, было установлено, что пиридилфениленовые дендримеры всех трех генераций являются модуляторами процесса фибриллизации альфа-синуклеина, не ингибируя, а катализируя его амилоидную трансформацию и направляя ее в сторону образования морфологически разнообразных структур, включая стабильные белок-дендримерные пленки в случае дендримеров 4 генерации. Полученные данные расширяют понимание фундаментальных механизмов взаимодействий «дендример-белок» и открывают перспективы для использования таких комплексов для стимулирования амилоидной трансформации альфа-синуклеина с целью получения новых клеточных моделей синуклеинопатий. Кроме того, стабильные белок-дендримерные пленки могут найти разнообразное применения, прежде всего, при создании диагностических систем. В журнале «INEOS OPEN» принята к публикации статья «Образование композитных структур пиридилфениленовыми дендримерами с альфа-синуклеином». Было показано, что белок нуклеокапсида (N-белок) ускоряет формирование затравок и ядер нуклеации будущих фибрилл альфа-синуклеина, а рецептор-связывающий домен S-белка SARS-CoV-2 (RBD) значительно замедляет данный процесс. При формировании в присутствии белков коронавируса структура и свойства фибрил альфа-синуклеиа существенно изменяется. Было доказано, что единственный неспаренный цистеин Cys538 в RBD подвергается нитрозилированию с образованием S-NO группы, которая может быть окислена до сульфеновой кислоты (S-OH). Хотя нитрозилирование само по себе не влияет на связывающую способность RBD с клеточным рецептором ACE2, однако его последующее окисление приводит к значительному снижению сродства между двумя белками. Проведенные исследования позволяют предложить гипотезу о роли нитрозативного и окислительного стресса в патогенезе COVID-19, регулирующих взаимодействие RBD с рецептором ACE2. В 2025 г. опубликовано 3 экспериментальных статьи (2 совместно с иранскими коллегами): Int J Biol Macromol ( Q1, IF-8.5), Arch Biochem Biophys (Q1, IF-3.0) и Biochimie (Q2, IF-3.0). Одна статья принята в печать. В 2025 году осуществлялся обмен информацией и препаратами между российскими и иранскими партнерами, были организованы совместные семинары, выступления на конференции и опубликованы 2 статьи. 1-месячный визит основного исполнителя проекта М.В. Медведевой в Иран позволил получить перспективную мутантную форму альфаВ-кристаллина.

Публикации