Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) здорового донора были получены нейрональные предшественники, комиттированные в дофаминергические нейроны. В целом, полученная нейрональная культура характеризуется высоким уровнем однородности и функциональной стабильности. Проведённое иммунофенотипирование подтвердило принадлежность клеток к нейрональному фенотипу и низкую активность процессов митохондриальной динамики. Культура демонстрирует активную спонтанную аутофагию и умеренно высокий уровень апоптоза при минимальной экспрессии маркеров воспаления, старения и повреждения клеток. Большинство клеток сохраняет жизнеспособность, но удлинение сроков культивирования способствует тенденции к падению митохондриальной активности, гиперпродукции активных форм кислорода и снижению уровней внутриклеточных пиридиновых нуклеотидов. Таким образом, клетки подходят для задач трансплантации, но должны быть имплантированы в ткань головного мозга животных-реципиентов в максимально ранний период их пребывания в условиях in vitro. Нейрональные предшественники, комиттированные в дофаминергические нейроны, были трансплантированы гомолатерально в стриатум крыс с моделью паркинсонизма, индуцированного односторонним интранигральным введением нейротоксина 6-OHDA. Трансплантацию проводили через 25 дней после введения нейротоксина. Морфологический анализ показал, что на 3-й и 6-й месяц после операции в трансплантате выявляются нейроны человека. Анализ специфических маркеров Nes и NeuN свидетельствуют не только о росте количества дифференцированных нейронов со временем, но и о завершении созревания трансплантата. К 6 месяцам интенсивность флуоресценции при выявлении АТФ-синтазы в трансплантированных нейронах была статистически значимо выше по сравнению с более ранними сроками, что может свидетельствовать как о наработке митохондриальной массы, так и о завершении переключения клеток с гликолиза на окислительное фосфорилирование. В трансплантированных клетках наблюдались колебания уровня белка деления митохондрий Drp1, ассоциированные с изменениями морфометрических параметров митохондриальной фракции. При этом по мере созревания трансплантата отмечали увеличение объема митохондрий в клетке. С развитием трансплантата наблюдается рост нейритов клеток и увеличение размеров их сомы и ядер. Постепенные, разнонаправленные изменения экспрессии NSE и DCX отражают продолжительность процессов созревания и дифференцировки нейронов в трансплантате. Экспрессия синаптофизина в трансплантате постепенно возрастала и значимо увеличивалась через 6 месяцев, что отражает увеличение числа синаптических связей между трансплантированными нейронами и окружающими клетками хозяина и связано с функциональной активностью трансплантата. На 3-й месяц, с ростом окрашивания на синаптофизин, наблюдалось значимое увеличение экспрессии альфа-синуклеина (аSyn) в трансплантате, что подчеркивает связь синаптогенеза с содержанием аSyn. К 3-му месяцу наблюдался также резкий рост окрашивания на аSyn в соме клеток трансплантата. Эти результаты согласуются с представлениями о транслокации аSyn из ядра в цитоплазму нейронов по мере их развития в культуре. К 6-му месяцу интенсивность окрашивания на аSyn в соме снижалась, но значимо возрастала в ядре, а ядерно-цитоплазматическое отношение вновь увеличилось. Это может отражать нарастающие с развитием трансплантата негативные процессы, так как локализация синуклеина в ядрах зрелых нейронов ассоциирована с развитием нейродегенеративных изменений при болезни Паркинсона. Таким образом, высокое содержание аSyn в развивающихся нейронах может быть ключевым фактором развития протеинопатии в клетках трансплантата. Продолжительное повышение экспрессии аSyn в трансплантированных клетках на этапе становления синаптической организации трансплантата может увеличивать вероятность переноса и распространения патологических форм белка в трансплантированные нейроны. В отчетном году был выполнен дополнительный раздел работы, связанный с оценкой возможностей влияния транскраниальной электростимуляции (ТЭС) на выживаемость и фенотип трансплантированных нейронов. Совместно с МГТУ им. Н.Э. Баумана был спроектирован и технически реализован образец многоканального аппарата для осуществления ТЭС у крыс, поддерживающего различные режимы работы. Крысы с 6-OHDA-индуцированным паркинсонизмом после нейротрансплантации были разделены на 3 равные группы. В первой группе животным после нейротрансплантации проводили ТЭС; крысы второй группы после нейротрансплантации получили имитацию стимуляции; животным третьей группы после нейротрансплантации стимуляцию не проводили. ТЭС проводили на 5-е сутки после трансплантации. Были также сформированы две дополнительных группы контроля: животные без введения 6-OHDA и с введением 6-OHDA, которым клеточный трансплантат не вводили. Тестирование поведения животных проводили через 25 дней после нигрального введения 6-OHDA до введения клеток, по окончании курса ТЭС спустя 3 недели после нейротрансплантации и спустя 3 месяца после нейротрансплантации. Введение 6-OHDA приводило к значимому снижению двигательной активности животных, а далее на фоне ложной ТЭС двигательная активность осталась на уровне, зафиксированном до введения клеток, тогда как после истинной ТЭС пройденная животными дистанция увеличилась более чем вдвое. В тесте «сужающаяся дорожка» через 3 недели после нейротрансплантации также выявлены значимые различия между группой активной стимуляции и контролем. При постмортальном морфологическом исследовании у животных, подвергнутых ТЭС, размеры трансплантата оказались больше по сравнению с контролем. Исследование специфических маркеров показало влияние ТЭС на формирование синаптических контактов с трансплантированными нейронами. Стимуляция также способствовала делению части клеток, находящихся на ранних стадиях дифференцировки. Проведена Российско-Китайская школа молодых ученых «Механизмы ускоренного старения головного мозга при болезни Паркинсона» (Москва, Нейрофорум-2024, 27 июня 2024 года).

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
1. Экспериментальные исследования in vitro. На индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (ИПСК) от здорового донора, дифференцированных в дофаминергические предшественники, установлено, что при стрессе эндоплазматического ретикулума (ЭПР) имеет место значимое снижение числа апоптотических клеток. Оценка экспрессии LC3b (маркера аутофагии) и морфологии окрашивания подтвердила запуск механизмов аутофагии. Стресс ЭПР приводил к ускоренному старению дофаминергических предшественников, что выражено в увеличении числа сенесцентных клеток, экспрессирующих бета-галактозидазу; наблюдалось также снижение уровней НАД+/НАДН в кондиционированной среде дофаминергических предшественников. В клетках при стрессе ЭПР наблюдалась устойчивая дозозависимая тенденция к увеличению экспрессии генов NLRP3 и IP3R1. Статистически значимые различия были обнаружены и в экспрессии генов шаперонов SIGMAR1 и HSPA5. При обработке клеток туникамицином экспрессия гена SIGMAR1 повышалась до 3 раз, а гена HSPA5 – более чем в 50 раз. Следовательно, нейрональные предшественники эффективно рекрутируют различные молекулярные механизмы ответа на ЭПР-стресс. Полученные данные свидетельствуют о чувствительности предшественников дофаминергических нейронов к индукции ЭПР-стресса, вовлеченности в эти события контактных сайтов мембран митохондрий и эндоплазматического ретикулума, развитии редуктивного стресса и снижении продукции проангиогенного фактора. Это определяет риск развития вторичных – индуцированных в ткани реципиента – изменений в клетках при их трансплантации, которые могут быть связаны с влиянием локальных факторов старения и воспаления (по механизмам ЭПР-стресса) и ассоциированы с неэффективным неоангиогенезом. 2. Экспериментальные исследования in vivo. 2.1. Моделирование паркинсонизма с использованием интранигрального введения эндотоксина липополисахарида (ЛПС). В 2025 году была создана ЛПС-опосредованная модель “двойного удара” для воспроизведения паркинсонизма у крыс: в качестве первого «удара» использовалось нейротоксическое воздействие лактацистином (ЛЦ) на область компактной части черной субстанции (кчЧС), а в качестве второго – ЛПС-индуцированное системное воспаление. Эта модель сопоставлялась с классическим интранигральным введением ЛПС. 2.1.1. Модель паркинсонизма, индуцированная интранигральным введением ЛПС. Тест «Сенсорный геминеглект» выявил значимую разницу времени выполнения заданий левой лапой по сравнению с правой у крыс группы ЛПС. В тесте «сужающаяся дорожка» (СД) показано различие в количестве соскальзываний левыми конечностями в группах ЛПС по сравнению с контролем. Интранигральное введение ЛПС приводило к значимому уменьшению числа дофаминергических нейронов в правой кчЧС, при этом наблюдалось увеличение интенсивности иммуноокрашивания на альфа-синуклеин. 2.1.2. Комбинированная модель, индуцированная интранигральным введением ЛЦ и системным введением ЛПС. В тесте “лестница с перекладинами” у животных с комбинированной моделью паркинсонизма (ЛЦ+ЛПС) выявлено значимое снижение качества выполнения шага при движении передними конечностями по сравнению с контролем. В тесте СД установлено, что введение ЛЦ (изолированное и в сочетании с ЛПС) не вызывало выраженных двигательных нарушений, тогда как у крыс группы ЛПС зафиксированы значимые различия по числу оступаний конечностями с правой и левой стороны и по времени прохождения теста. У животных, получавших ЛЦ или подверженных комбинированному воздействию токсинов, отмечалось снижение числа стоек в оба дня и снижение количества актов груминга во 2-й день тестирования. Морфологический анализ на IBA1 выявил значимое увеличение числа активированных клеток микроглии в поврежденном полушарии в ответ на воздействие как монотоксинов, так и комбинированное воздействие. Таким образом, как моно-введение токсинов, так и их сочетание, вызывало изменения двигательной активности, показателей моторных функций и эмоционального состояния животных. При этом степень однородности выраженности этих изменений была значимо выше в группе с моделью «двойного удара». 2.2. Эффекты транскраниальной стимуляции (ТЭС) переменным током на состояние клеточного трансплантата и моторные симптомы 6-ГДА-индуцированного паркинсонического синдрома у крыс. Крысы с односторонним введением нейротрансплантата в хвостатое ядро были разделены на 6 групп: 1) Модельные животные с трансплантатом (6ГДА+Т+К). 2) Модельные животные с трансплантатом, ложной стимуляцией и седацией (6ГДА+Т+С). 3) Модельные животные с трансплантатом и стимуляцией с частотой 4 Гц (6ГДА+Т+ТЭС1). 4) Модельные животные с трансплантатом и стимуляцией с частотой 20 Гц (6ГДА+Т+ТЭС2). 5) Контрольные животные с трансплантатом (К+Т+К). 6) Контрольные животные с трансплантатом и стимуляцией с частотой 20 Гц (К+Т+ТЭС). В тесте «лестница с перекладинами» наблюдали значимое снижение качества выполнения шага левыми конечностями у контрольных животных с трансплантатом и модельных крыс по сравнению с контролем. По шкале невротизации отмечено превышение суммарного балла у модельных животных относительно контроля, тогда как у животных в группе “6ГДА+Т+С” и “6ГДА+Т+ТЭС1” этот показатель на уровне контрольных значений. В тесте «Цилиндр» выявлено уменьшение использования левой передней лапы, контралатеральной стороне повреждения мозга, у всех модельных животных по сравнению с контролем. При этом достоверных отличий в числе касаний левой лапой стенки цилиндра у групп “К+Т+ТЭС” и “6ГДА+Т+ТЭС2” не наблюдали. Полученные результаты свидетельствуют о наличии выраженных двигательных и эмоциональных нарушений у животных с 6-ГДА-индуцированным паркинсонизмом. В результате нейротрансплантации получено значимое улучшение показателя использования передней конечности на стороне, контралатеральной повреждению, что может свидетельствовать о частичном восстановлении моторных функций. Применение ТЭС радикально не повлияло на показатели поведенческого тестирования, но показало большую однородность значений в группе с ТЭС 4 Гц, чем в группе ТЭС-20 Гц. По итогам работы опубликованы или приняты в печать 3 статьи.