Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В ходе выполнения работ в 2024 г. в рамках проекта №24-45-10012 синтезированы наногели на основе поли-N-изопропилариламида (ПНИПАМ) и модифицированного олигоэфира пентаэритрита, а также наногели с повышенной гидрофильностью на основе ПНИПАМ, метокси-полиэтиленгликоля (М-ПЭГ) и N,N’-метиленбисакриламида (МБАА). Показано, что наногели на основе ПНИПАМ и олигоэфира пентаэритрита характеризуются широким распределением частиц по размерам и полидисперсностью, в то время как наногели с повышенной гидрофильностью, содержащие в своей структуре М-ПЭГ, отличаются высокой гомогенностью и стабильностью. Установлено, что полученные наногели на основе ПНИПАМ характеризуются температурно-индуцированным коллапсом в интервале температур от 32°С до 36°С. Для определения более точного интервала НКТР, необходимого для последующей разработки методических подходов к загрузке и высвобождению терапевтических агентов в структуру наногелей, отобранные образцы наногелей, охарактеризованы методами электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и турбидиметрии. С помощью ЭПР проанализирована доля образующихся полимерных глобул и выявлена концентрационная зависимость температурного интервала протекания коллапса наногеля. Установлено, что температура помутнения отдельных наногелей составляет 31°С. В связи с тем, что при последующей сборке системы и ее тестировании на животных моделях к ожоговым покрытиям предъявляется требование стерильности, нами дополнительно проанализирована возможность получения стерильных наногелей с сохранением интервала их температурно-индуцированного коллапса в диапазоне 32°С -36°С. В результате оценки биосовместимости наногелей in vitro показано, что выживаемость первичных мезенхимных стромальных клеток (МСК), выделенных из десны человека, в результате 24-часовой инкубации синтезированных наногелей, в среднем, составляет 90%±5%. При этом увеличение продолжительности инкубации приводит к приводящей к снижению выживаемости МСК на 50%. В результате 24- и 48-часовой инкубации наногеля с кератиноцитами человека HaCaT средняя выживаемость клеток составляет 89,9%±5,8% и 88,9%±9,1% соответственно. Полученные результаты демонстрируют биосовместимость синтезированного наногеля в отношении целевых клеток, представляющих окружение в зоне ожогового поражения. Для последующей сборки гибридного наноструктурированного гидрогеля нами проведен скрининг возможных композиций гидрогеля-внешнего носителя на основе гиалуроновой кислоты (ГК), а также установлены параметры их вязкости и проанализирована возможность получения стерильного гидрогеля ГК. Была разработана методика электроформования скаффолдов на основе ГК. Установлено, что полученные матриксы имеют пористо-волокнистую структуру, их толщина матриксов составляет 33,2 ± 2,9 мкм, а волокон - 100±30 нм, линейный размер пор между волокнами варьирует от 300 нм до 1000 нм. С целью повышения механической стабильности каркаса конструируемой гибридной системы разработана методика получения сшитого гидрогеля ГК. Полученный сшитый гидрогель ГК механически стабилен и характеризуется величиной модуля сохранения сшитого гидрогеля выше модуля потерь и достигает 300 Па. Для оптимизации сборки стерильной комбинированной системы нами дополнительно проанализирована возможность стерилизации и использования альтернативного варианта гидрогеля-носителя сшитого полимера на основе полиакриловой кислоты как наиболее устойчивого к эффектам стерилизации и не требующим введения дополнительных сшивок, что является непосредственным его преимуществом. Для последующего анализа биофармацевтических свойств наногелей и гибридного наноструктурированного гидрогеля с использованием технологии 3D сфероидов нами разработана модель эквивалента кожи с использованием кератиноцитов человека линии HaCaT (моделирующих эпидермис) и иммортализованных фибробластов человека линии 977 hTert (моделирующих дерму). Разработаны и сконструированы микрофлюидные чипы, обеспечивающие оптимальный ламинарный поток жидкости без возникновения турбулентных или переходных зон. Сфероиды, культивируемые на коллагеновой мембране в микрофлюидном чипе в течение 96 ч, сохраняли хорошую жизнеспособность. Установлено, что активная реактивация сфероидов и миграция клеток обеспечивают общую высокую клеточную плотность при их культивировании в микрофлюидном чипе. В рамках реализации проекта в 2024 г. опубликована 1 статья в зарубежном журнале, индексируемом в Scopus и Web of Science, входящим в первый квартиль (Q1) и в перечень научных изданий «Белого списка» (https://journalrank.rcsi.science/ru/). 1 статья подана и принята в печать в журнал «Mendeleev Communications», цитируемом в Scopus и Web of Science и входящем в перечень научных изданий «Белого списка». Результаты работы были представлены в форме устных и стендовых докладов на 7 научных конференциях, а также представлены широкой общественности на радио и на сайте www.sechenov.ru. На следующем этапе реализации проекта будет проведена дальнейшая оптимизация структурно-функциональных свойств термочувствительных наногелей с целью обеспечения их последующей интеграции в гидрогель-носитель и получения гибридных наноструктурированных покрытий, инкапсулирования терапевтических агентов, будет проведена оценка биофармацевтических свойств системы в условиях in vitro с использованием монослойных культур клеток и эквивалента кожи, а также будет проанализирована биосовместимость синтезированных наногелей и гибридной гидрогелевой системы in vivo при подкожной имплантации у малых лабораторных животных (мышей). Будет опубликовано не менее 4 статей в международных журналах, индексируемых в Scopus и/или Web of Science, входящих в перечень научных изданий «Белого списка». Разрабатываемый подход позволит повысить эффективность лечения ожоговых повреждений кожи за счет сочетанных активного (стимул-контролируемого) и пассивного высвобождения терапевтических компонентов для лечения термических повреждений зоне ожогового поражения, полученные результаты будут служить базой для последующей трансляции данного покрытия в клиническую практику. Предлагаемый подход позволит увеличить продолжительность и качество жизни пациентов с ожоговыми поражениями кожи, что является одной из ключевых задач Стратегии научно-технического развития РФ и обуславливает связь данного проекта с формированием научных и технологических заделов, обеспечивающих экономический рост и социальное развитие РФ, в частности, в области разработки лекарственных платформ нового поколения с их дальнейшей трансляцией на этап использования в клинике.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В рамках реализации второго этапа проекта №24-45-10012 были синтезированы лоты микро-/наногелей со следующими составом: (1) N-изопропилакриламид (ПНИПАМ); (2) ПНИПАМ-10% метокси(олигоэтиленоксид)метакрилат (МПЭГ); (3) ПНИПАМ-10%МПЭГ-7% метакриловая кислота (МАК); (4) ПНИПАМ-7%МАК; (5) ПНИПАМ-10%МПЭГ-3%МАК; (6) ПНИПАМ-3%МАК. Полученные образцы характеризуются высокой гомогенностью, средним размером частиц не менее 320 нм и не более 1000 нм, а также коллоидной стабильностью в водных/буферных средах. При этом, включение в структуру МПЭГ и МАК позволяет улучшить стабильность при температуре выше НКТР в среде буфера, в том числе в условиях коллапсирования полимерной сетки. Был разработан подход к флуоресцентному мечению микро-/наногелей с целью последующей их визуализации. При прямом их допировании с помощью флуоресцентно-меченого конъюгата БСА-ФИТЦ, несмотря на высокую эффективность его включения (в среднем, 92,4%±5,9%), отмечена низкая интенсивность флуоресценции, что может быть обусловлено десорбцией конъюгата или его вымыванием из полимерной сетки. Однако ковалентное соединение флуорофора с карбоксильной группой мономерных звеньев МАК, сшитых с ПНИПАМ/ПНИПАМ-МПЭГ, посредством карбодиимидной реакции, позволяет получать яркие микро-/наногели с интенсивным сигналом, легко визуализируемые с помощью флуоресцентой микроскопии. Структурно-механические и термочувствительные свойства микро-/наногелей были охарактеризованы с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ). Установлено, что частицы имеют округлую, сферическую форму и обладают термочувствительными свойствами, что подтверждается высокими значениями относительного изменения модуля упругости (ΔE/E₀ > 800%) и значительной степенью усадки (49-79%). Температура перехода варьируется в диапазоне от 37°C до 42°C. При этом включение МПЭГ оказывало комплексное влияние на их механические свойства, увеличивая температуру фазового перехода. В рамках разработки подхода к инкапсулированию терапевтических агентов в качестве модельных веществ использовали бычий сывороточный альбумин (БСА) и бацитрацин, которые являясь легко растворимыми в водных средах, позволяют осуществлять их загрузку в структуру матрицы микро-/наногелей путем пассивной диффузии. В случае БСА максимальная степень загрузки (98,9%±1,3%) отмечена после 8 ч инкубации. Максимальная достигнутая степень инкапсулирования бацитрацина составляет 48,3%±5,4%. Анализ кинетики высвобождения бацитрацина и БСА из микро-/наногелей в среде 0,01 М фосфатно-солевого буфера (ФСБ) рН 7,4, имитирующего физиологический рН при температуре 37°С, показал наличие высокой интенсивности высвобождения из матрицы обоих модельных агентов. При этом после 60 мин в случае БСА наблюдается замедление диффузии, а в случае бацитрацина, напротив, достигается полное высвобождение. В условиях коллапса полимерных цепей ПНИПАМ-10%МПЭГ высвобождение бацитрацина из микро-/наногелей характеризуется быстрой кинетикой, в то время как высвобождение БСА является более пролонгированным и, вероятно, носит двухступенчатый характер. Наблюдаемые различия могут быть обусловлены как различием в молекулярной массе модельных терапевтических агентов, так и характере их десорбции. Для формирования гибридной системы на основе термочувствительных микро-/наногелей использован носитель на основе полиакриловой кислоты, в который вводили ПНИПАМ-10%МПЭГ. Была подтверждена стабильность микро-/наногелей и выбранного гидрогеля-носителя после стерилизации автоклавированием. Биофармацевтические характеристики микро-/наногелей в условиях in vitro оценивали с использованием монослойных культур клеток и эквивалента кожи (сфероиды, состоящие из фибробластов и кератиноцитов (10.1016/j.bioadv.2025.214582)). Показано, что микро-/наногели интернализуются кератиноцитами человека в монослойной культуре при различных продолжительностях инкубации (1-24 ч). При этом не выявлено существенных различий по эффективности поглощения микрочастиц клетками. При инкубации микро-/наногелей со сфероидами установлена прямая зависимость эффективности интернализации от длительности инкубации: наиболее эффективная интернализация отмечена при инкубации в течение 16 ч, а интернализация ПЭГилированных микро-/наногелей, проходила менее эффективно. Была оценена биосовместимость микро-/наногеля и гибридного геля в условиях in vivo при подкожной имплантации у мышей. Выявлен дозозависимый характер реактивного изменения кожного покрова животных в ответ на имплантат. Результаты гистологического анализа показали, что подкожная имплантация микро-/наногеля в концентрации 0,2 мг/мл вызывает ограниченный и обратимый иммунный ответ в виде нейтрофильной реакции с инфильтрацией эпителия, проходящий к 7 сут. При этом введение 2 мг/мл микро-/наногелей провоцирует более выраженную нейтрофильную реакцию, которая к 3 сут затрагивает дерму, подкожно-жировую клетчатку и фасциальные ткани, но к 7 сут сопровождается образованием бурого жира (активация регенеративных процессов). На 14 и 21 сут эксперимента структура кожи нормализуется. При имплантации гибридного микро-/наноструктурированного геля визуально не отмечали наличия воспалительной реакции. Полученные данные подтверждают, что включение микро-/наногелей в гидрогель-носитель позволяет предотвратить развитие воспаления и обеспечить их лучшую биосовместимость. В рамках реализации проекта в 2025 г. опубликовано 2 статьи в зарубежных журналах, входящих в первый квартиль (Q1). Результаты работы были представлены в форме устных и стендовых докладов на крупнейших научных конференциях, таких как FEBS и TERMIS-AP. На следующем этапе будет сформирована единая гибридная микро-/наноструктурированная гидрогелевая терапевтическая система для лечения ожогов, ее функциональные свойства будут валидированы в условиях in vitro и in vivo (модель ожогового повреждения кожного покрова у животных (минипиги). Будет опубликовано не менее 7 статей в международных журналах, входящих в перечень научных изданий «Белого списка». Результаты исследования будут представлены и обсуждены на ключевых международных и национальных конференциях. Реализация комбинированного механизма доставки терапевтических агентов для лечения кожных повреждений при ожогах позволит существенно улучшить комплаентность лечения и эффективность регенерации кожи в зоне ожогового поражения. Полученные результаты позволят разработать прототип системы для терапии подобных повреждений, которая в дальнейшем будет зарегистрирована как медицинское изделие, а также протокол лечения, пригодный для дальнейшего внедрения в клиническую практику.