Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В рамках исполнения двустороннего проекта участники российского научного коллектива посетили Институт Пастера в Иране. Был проведен ряд совместных научных семинаров с целью согласования методологических подходов, которые будут использоваться при решении научных задач. Определены протоколы сбора полевого материала (клещи) и дальнейшей работы по изучению разнообразия переносимых ими патогенов. https://www.pasteurorg.ru/article/225/4317/Uchenye-Instituta-posetili-Iran-v-ramkah-provedeniya-sovmestnogo-nauchnogo-proekta Как и планировалось, начат сбор полевого материала. Сбор проводился в Дальневосточном федеральном округе, Северо-Западном федеральном округе, в Удмуртской Республике, Республике Крым и Ярославской области. Всего было собрано более 4000 образцов (клещей). Наибольшее количество особей отнесено к виду Ixodes ricinus и Ixodes persulcatus, около 2000 особей каждого вида. Также были зарегистрированы представители рода Dermacentor (120), Haemaphysalis punctata (83), Haemophysalis japonica (17), Haemaphysalis concinna и Hyalomma marginatum (по 1), Rhipicephalus bursa (3), Rhipicephalus sanguineus (72), Ixodes pavlovskyi (7) и два пула напитавшихся клещей Ixodes uriae. С иранской стороны собрано 1045 клещей, на данный момент происходит их типирование. Был произведен дизайн праймеров и зондов для проведения ОТ-ПЦР в реальном времени для выявления нуклеиновых кислот вируса SFTSV, клещевых пятнистых лихорадок и лихорадки Ку. Были созданы положительные контрольные образцы. При разработке системы на Ку-лихорадку был взят участок элемента IS1111, для риккетсий участки генов цитратсинтазы и 50S рибосомного белка L16, а для SFTSV на сегменте L был выбран участок РНК-зависимой РНК полимеразы. Все последовательности контролей собирались de novo методом ПЦР в один шаг. Для бактерий контролем является плазмида pGEM, содержащая целевой участок. Для вируса SFTSV кроме плазмиды pGEM также был создан защищенный РНК-контроль на основе модифицированных частиц фага MS2. На панели нуклеиновых кислот вируса геморрагической лихорадки Крым-Конго из коллекции Ставропольского противочумного института был апробирован разработанный ранее набор для детекции ККГЛ. И, хотя набор имел высокую чувствительность на образцах из других регионов, в том числе и в Африке, линию циркулирующую на территории Ставропольского края и респ. Калмыки, имеющую название Европа-3, данный набор выявлял меньше чем в половине случаев. В связи с этим были выбраны дополнительные праймеры и зонд, которые позволили детектировать в том числе и эту линию вируса. Как оказалось, имеющиеся коммерческие наборы российского производства также имеют данный недостаток, и показывают на этой линии ложноотрицательные результаты. В связи с чем именно наша новая смесь будет использована для дальнейшего поиска вируса ККГЛ в клещах, собранных с эндемичных регионов. В рамках работы также начато исследование по распространенности и филогенетическому анализу вируса клещевого энцефалита в клещах, собранных на территории Северо-Западного Федерального округа в 2015-2022 годах. В работе было использовано 2812 клеща из коллекции Института. РНК ВКЭ была обнаружена у 68 (2,4%) имаго клещей, в том числе у 61 I. persulcatus (3,2%) и у семи I. ricinus (0,8%), в 20 из 93 точек сбора, расположенных на северо-западе России. В процессе пробоподготовки только десять образцов изолятов вируса оказались пригодны для дальнейшего генотипирования методами высокопроизводительного секвенирования (Illumina MiSeq). Филогенетический анализ проводился по белку Е и показал, что все десять проанализированных штаммов относятся к сибирскому подтипу. Внутри сибирского подтипа полученные изоляты были разделены на две группы: балтийскую и группу Васильченко. Результаты филогенетического анализа с использованием кластеронной структуры также свидетельствуют о том, что большинство изолятов относятся к сибирскому подтипу, балтийской филогенетической линии, кластерону 3D. Однако некоторые изоляты были идентифицированы как уникальные и могут образовывать новые кластероны. По данной части работы написана статья, которая на данный момент находится в стадии публикации.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В отчетный период 2025 года в соответствии с планом завершена разработка диагностических систем на основе метода ПЦР/ОТ-ПЦР для выявления нуклеиновых кислот клещевых пятнистых лихорадок, Ку-лихорадки и вируса SFTSV. На большей чем в прошлом году выборке проверен набор на ККГЛ, по результатам в состав набора будут внесены дополнительные изменения. Помимо этого провели филогенетические исследования и внесли изменение в систему для детекции TBEV, разработанную ранее. Изменения касались улучшения чувствительности для линий, циркулирующих на северо-западе России. Был продолжен сбор полевого и клинического материала. Собрано 600 клещей на территории Р. Крым. На территории Ставропольского края собрано 370 пулов иксодовых клещей и 130 пулов на территории Р. Абхазия. Также собрано 40 сывороток крови от больных КГЛ в субъектах ЮФО и СКФО. Проводили анализ материала собранного ранее на наличие нуклеиновых кислот патогенных/потенциально патогенных микроорганизмов. В одном из пулов клещей Дальнего Востока родовыми праймерами найден вирус Парамушир. В ходе изучения метавирома клещей, собранных в СЗФО, в клещах из Республики Карелия детектирован Phlebovirus mukawaense. Проведено полногеномное секвенирование, проведены филогенетические исследования, подробные результаты отражены в статье «Distribution of Mukawa virus (Phlebovirus mukawaense) in Russia». В образцах клещей из Р. Крым обнаружена ДНК Rickettsia spp. Выбраны и использованы праймеры для видовой дифференциации, определено 4 вида: R.slovaca , R. conorii subsp. raoultii , R. massiliae, R. helvetica. Также найдена ДНК бактерии Borrelia burgdorferi (sensu lato). В рамках проекта было проведено исследование циркуляции вируса ККГЛ на территории Армении в клещах собранных в 2022-2023 годах. Было проведено фрагментное секвенирование 9 изолятов, для 6 из них – полногеномное. Определены подгруппы линии Europe 1 к которым они принадлежат: Armenia 1, Armenia 2 и Vb. Показана реассортация внутри этой линии. Результаты более подобно описаны в статье «Genetic features of Orthonairovirus haemorrhagiae variants detected in ixodid ticks in Armenia». В следующем году планируем разработать методику полногеномного секвенирования Coxiella burnetii - возбудителя лихорадки Ку. Данные бактерии являются труднокультивируемыми, а при прямом секвенировании полевого и клинического материала большая часть прочтений приходится на ДНК хозяина. С другой стороны, как и прочие альфапротеобактерии, C. burnetii является высококонсервативной, что затрудняет проведение филогенетического анализа по фрагментам генома. Предполагается использовать эту методику как для материала из РФ, так и из Ирана. Будем продолжать исследование собранного материала различными методами, в том числе и NGS.