Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В 2024 году в рамках выполнения проекта № 24-45-20007 разработан дизайн блока реотаксиса путем компьютерной симуляции динамики потоков и параметров, влияющих на эффективность отбора. Было предложено 5 архитектур, которые отражали различный механизм отбора клеток и были использованы для in silico моделирования с целью установления оптимальных значений скорости потока и геометрических параметров. Для одноканального типа было показано, что при использовании 2D модели различие в результатах при ламинарном течении и течении Стокса отсутствует, в то время как при использовании 3D модели оно составило около 200 мкм/с. В связи с этим в каналах проводили однофазное моделирование с ламинарным потоком. В блоках с более сложной архитектурой при моделировании однофазного и двухфазного потока выявлено расхождение в расчетной максимальной скорости, которая составила 50 мкм/с. Были подобраны для модели типа «Ловушка» скорость потока на входе (200 мкм/с) и давление в боковых резервуарах (50 Па), для модели типа «Диффузор» скорость потока с учетом оптимальной скорости сдвига в “зоне малого сдвига” (400 мкм/с), для модели типа «Лестница» скорости потока на входе для жидкости (30 мкм/с) и для сперматозоидов (7-8 мкм/с), а также оптимальные значения ширины основного канала, области реотаксиса и бокового канала. При моделировании движения сперматозоидов были установлены значения скорости сдвига в области реотаксиса в блоке типа «Ловушка» (5-10 1/с), «Лестница» (10-15 1/с) и показано, что сперматозоиды в блоке типа «Лестница» реориентируются быстрее (4-5 шагов), чем в блоке типа «Ловушка» (20-30 шагов). Был разработан дизайн прототипа блока платформы для оценки гиалуронидазной активности сперматозоидов и разработан протокола его формирования. Предварительно для повышения гидрофильности поверхности предложено покрытие полидиметилсилоксана (ПДМС), из которого изготовлен корпус блока, полиэтиленгликолем (ПЭГ). Показано, что подход “grafting to” обеспечивал снижение значения краевого угла смачивания до 38° на 4е сутки, но с устойчивой тенденцией к деградации покрытия; подход “grafting from” приводил же к получению более устойчивых покрытий, обеспечивающих значение краевого угла смачивания 17° в течение 3-4 недель. Методом ИК-спектроскопии были выявлены характеристические колебания в диапазонах 1200-1150 см-1 (С-О-С) и 2900-2850 см-1 (-О-СН3-), свидетельствующие о формирование слоя ПЭГ на поверхности ПДМС. Нанесение пленок гиалуроновой кислоты, необходимых для оценки гиалуронидазной активности, достигали 2 способами – дроп-коутинга и спин-коутинга. Второй способ показал большую эффективность и позволял сформировать сплошные пленки толщиной 1,1-1,45 мкм, характеризующиеся шероховатостью в сухом состоянии в диапазоне 376-386 нм. Определение ответа клеток на хемоаттрактанты было осуществлено в блоке хемотаксиса, созданного на основе микрофлюидных миксеров Y-формы, позволяющих формировать градиент концентраций веществ, с предварительным in silico моделированием их распределения в канале.При проведении in vitro экспериментов установлено, что введение 10 и 100 нМ прогестерона приводило к перемещению сперматозоидов в сторону канала с более высокой концентрацией хемоаттрактанта, что подтверждается данными трекинга движения сперматозоидов (67-75% подвижных сперматозоидов, достигших целевой области разделения демонстрировали перемещение по отношению к градиенту концентрации прогестерона). При использовании окситоцина в качестве хемоаттрактанта выявлена меньшая селективность перемещения сперматозоидов в целевую область (50-70% сперматозоидов, демонстрирующих смещение в сторону целевой зоны). При определении связываемости с гиалуроновой кислотой образцов эякулята установили, что без дополнительной сшивки сформированные пленки обладали высоким коэффициентом набухания. Введение агарозы в их состав позволило избежать значимого набухания и обеспечивало прикрепление клеток к поверхности. Была установлена функциональность и эффективность сортинга как здоровых, так и патологически измененных сперматозоидов с помощью разработанного прототипа блока при анализе донорского материала. При условии перфузии в блоке реотаксиса скорость сперматозоидов варьировалась между 3 – 16 мкм/с, что с учетом скорости потока в канале позволило определить полную скорость как 180-190 мкм/с. При анализе образцов эякулята, подвергшихся предварительному нагреванию до 37°С (контроль) и оставленных при 25° (сперматозоиды со сниженной способностью к реотаксису), установлено, что разработанный прототип блока позволял успешно осуществить отбор жизнеспособных подвижных клеток. В рамках разработки алгоритма применения разрабатываемой платформы были обучены и оценены две модели (YOLOv10nano и YOLOv8) для решения задачи по детекции сперматозоидов. YOLOv8 показала высокую точность и стабильное снижение функций потерь, что свидетельствует о её успешном обучении и способности к обобщению при использовании новых данных На основании полученных данных подготовлена и подана 1 статья в журнал, индексируемый в Scopus и Web of Science и относящийся к первому квартилю, которая находится на рассмотрении (under review). Результаты проекта были представлены на крупных всероссийских и международных мероприятиях (в частности, Международный конгресс по фундаментальной и клинической урологии и онкоурологии (Уфа, Россия), Congress on Reproductive Biomedicine (Тегеран, Иран). В 2025 году планируется сформировать оптимизированный блок реотаксиса и оценить его функциональность, а также установить влияние вязкости буфера на сепарирование спермы в нем; создать интегрированную из отдельных разработанных блоков единую систему и показать ее функциональность; установить эффективность сортинга мужских половых клеток с ее помощью в сравнении с стандартными тестами, применяемыми в клинике; создать базу данных изображений образцов эякулята, аннотированных в соответствии со стандартами Всемирной организации здравоохранения.