Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Созданы несколько типов ГКР-активных мембран, из которых мембрана с магнетронным напылением оказалась наиболее перспективной, давая интенсивные и воспроизводимые ГКР-спектры. Получены микрофотографии РЭМ, на которых наблюдается сохранение структуры напыленной поверхности после фильтрации биологических объектов. Были выбраны оптимальные параметры регистрации спектров формазана. При использовании источника лазерного излучения с длиной волны 638 нм наблюдается эффект резонансного комбинационного рассеяния света. Максимальная эффективность достигалась на серебряных ГКР-поверхностях при возбуждении источником лазерного излучения 638 нм. Выбраны патогены для исследования, а также определена их устойчивость к антибиотикам. Были получены данные по определению МПК для нескольких штаммов микроорганизмов: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae и Staphylococcus aureus. Показано, что спектроскопия комбинационного рассеяния (КР) сопоставима по чувствительности определения формазана с колориметрическим методом, однако, КР дает специфическое определение формазана, исключая эффект среды. Оба метода удовлетворительно работают для 1-2 MFU бактерий (10^8 КОЕ/мл), не допуская дальнейшее снижение титра бактерий. В присутствие антибиотиков интенсивность КР-спектров чувствительных штаммов снижается, позволяя определять МПК как концентрацию, при которой наблюдается 50% снижение интенсивности спектра формазана. Показана хорошая корреляция между МПК, определенными КР и Е-тестом. Повышение чувствительности метода за счет использования ГКР-субстратов. В случае ГКР на золотых наночастицах предел обнаружения формазана составил 0,1 мкг/мл, что в 70 раз ниже, чем в случае КР-спектроскопии. Достоверное определение формазана наблюдалось при концентрации клеток в 3×10^5 КОЕ/мл в случае ГКР, тогда как для КР - 1×10^7 КОЕ/мл. Исследован эффект формы наночастиц на интенсивность ГКР-спектров формазана в бактериях. Золотые нанозвезды давали 5–10-кратно большую интенсивность спектра, в сравнении со сферическими наночастицами, в диапазоне титров бактерий 10^5–10^7 КОЕ/мл. Золотые нанозвезды давали наиболее интенсивный ГКР-сигнал, что делает их перспективным ГКР-субстратом для детекции формазана в биологических смесях. Были проведены работы с ГКР-активными мембранами. В случае высоких концентраций бактерий, 10^8-10^9 клеток E.coli штамм D1 в образце, в световом микроскопе можно увидеть большое количество материи, состоящей из длинных иголок (кристаллы формазана) и подкрашенных бактерий. Снижение концентрации бактерий позволяет увидеть отдельные объекты, 5-20 клеток на 50 мкм^2, дальнейшее снижение концентрации клеток в 10 раз позволяет выделять кадр с единичным объектом для съемки – 1-4 клетки на 50 мкм^2. Получены ГКР-спектры единичных бактерий. Титрование низких концентраций E. coli (штамм ΔtolC KanS 5’) было проведено на мембране 0,2 мкм. Было показано успешное определение бактерий вплоть до определения концентрации 10 КОЕ/мл, т.е. единичных бактерий в образце. Также мы попробовали оценить устойчивость к антибиотикам с использованием ГКР-мембран. Клетки E. coli ΔtolC в избытке канамицина имели сниженную интенсивность спектров. Аналогично, спектры S.aureus в присутствии 128 мкг/мл клиндамицина показали снижение конверсии МТТ с 90% до 60%. Аналогично, были получены спектры для Klebsiella pneumoniae, обработанных МТТ-реагентом и антибиотиком имипенемом в концентрации 8 мкг/мл. В этом случае в присутствии антибиотика снижалась более чем в 2 раза как интенсивность спектров формазана, так и конверсия МТТ. Организацией-соисполнителем синтезированы и охарактеризованы золотые наночастицы разных форм с разными стабилизаторами. В качестве наиболее перспективных для дальнейших исследований выбраны золотые нанозвезды с мицеллообразующим стабилизатором. Разработаны модели для расчета оптических спектров поглощения, рассеяния и экстинкции для разных типов наночастиц. Наночастицы были функционализированы ДНК-аптамером, специфично распознающим штамм ΔtolC E. coli. Полученные конъюгаты наночастиц и ДНК-аптамера использовались для качественной детекции бактерий посредством дот-анализа. Дот-анализ представляет собой разновидность твердофазного иммуноанализа. Для экспериментов использовалось 5 штаммов 4 видов бактерий: E. coli двух штаммов: ΔtolC и D1, S. aureus 209P, P. aeruginosa и A. baldaniorum Sp245. Полученные конъюгаты коллоидного золота и аптамера позволили не только осуществить специфическую детекцию и межвидовую дифференциацию, но и также различить разные штаммы бактерии E. coli. Установленный предел детекции для маркерных AuNPs составил 10^6 КОЕ/мл. (10 000 клеток в пробе). Маркерные SeNPs, функционализированные ДНК-аптамером также проявляли селективность в отношении штамма E. coli ΔtolC. Тем не менее, чувствительность анализа была ниже, чем для маркерных AuNPs: 10^7 КОЕ/мл (100 000 клеток в пробе). Подбор мембран и расходных материалов, совместимых с МТТ-реагентом и спектроскопией ГКР. Золотые нанозвезды были нанесены на полимерные мембраны для создания ГКР-активных поверхностей, имитируя накопление НЧ на тест-полоске. Нитроцеллюлозная, трековая и поливинилиденфторидная мембраны были исследованы. Измерение спектров формазана в концентрации 10 мг/мл показало, что в случае трековой мембраны наибольшее усиление сигнала наблюдается при наиболее низкой концентрации нанозвезд. Раствор формазана с концентрацией 0,1 мг/мл детектировался только на двух полимерных мембранах: трековой и поливинилиденфторидной. Низкая концентрация формазана (0,01 мг/мл) не детектировалась ни на одной мембране. Таким образом, трековые мембраны в сочетании с золотыми нанозвездами могут быть рекомендованы для определения формазана.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Подобраны ГКР-активные мембраны для получения спектров формазана от бактерий. Были изучены тонкие серебряные и золотые плёнки, полученные методами термического и магнетронного распыления, а также пленки, полученные осаждением коллоидных серебряных и золотых наночастиц. Серебряные наночастицы давали значительно больший ГКР-эффект по сравнению с золотыми. Принципиальные различия между методами нанесения наночастиц можно наблюдать на поперечных сечениях мембран. На напылённых плёнках заполняется преимущественно фронтальная поверхность, а при сорбции наночастиц большое количество наночастиц оказывается внутри пор. Наибольший коэффициент усиления, 4,9 ∙ 10^6, был получен для мембраны с термическим напылением серебра. Трековые ПЭТ-мембраны с шипообразной поверхностью имеют горячие точки на кончиках шипов, в области соединения шипа с мембраной, а также в местах спорадических дефектов в слое. Коэффициент усиления составил 7∙10^6. Это покрытие - самое стабильное среди исследованных, т.к. дает как минимум 10-кратное увеличение интенсивности после фильтрации биологических жидкостей по сравнению с планарными мембранами. Более того, новый тип мембраны не требует нормализации сигнала (RSD < 15%). Для дальнейшей работы с большим набором спектров было разработано программное обеспечение, которое имеет следующие функции: 1) позволяет загружать спектры в форматах .esp/.txt/.csv с "умным" парсером, 2) имеет интерактив на графике, 3) проводит анализ КР-полосы, 4) сохраняет результаты в формате .txt, 5) проводит анализ данных и калибровку. Разработанная программа позволит значительно ускорить работу по набору спектральных данных в экспериментах при исследовании влияния антибиотиков на процесс перехода МТТ в формазан (и для других реагентов). Была набрана статистика по точности определения минимальной подавляющей концентрации (МПК) с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния (МТТ-КР). Определенные МПК сравнивали с МПК, полученными методом микроразведений, а также граничными значениями, установленными EUCAST. Были исследованы: E.coli (6 штаммов) с клиндамицином, левофлоксацином и имипенемом, S.aureus (5 штаммов) с левофлоксацином, клиндамицином, ванкомицином, эритромицином и бензилпенициллином, 1 штамм K. aerogenosis с левофлоксацином, имипенемом и цефтриаксоном, K. pneumoniae (3 штамма) с левофлоксацином, имипенемом, цефтриаксоном, а также 1 штамм K. varicolae с левофлоксацином и имипенемом. В большинстве случаев (85%) полученные значения совпадают с ожидаемыми с точностью до шага разведения. В двух случаях МПК выше МПК, определённого методом микроразведений, в одном – выше ожидаемого граничного значения, в одном – ниже. Таким образом, показана возможность использования нового метода для оценки чувствительности бактерий к антибиотикам. Для подбора ДНК-аптамеров к бактериям были использованы три метода: биослойная интерферометрия, колориметрическая детекция и поляризация флуоресценции. По результатам исследований были определены IC50 для комплексообразования аптамеров с бактериями и подобраны следующие комбинации бактерия-аптамер: E. coli ATCC_25922 аптамеры apt_19 и apt_20 Staphylococcus aureus 209-P аптамеры SA61, SA23, MTCC, SA34 Staphylococcus aureus 25923 аптамер SA23 Klebsiella pneumoniae 204 аптамер MTCC Klebsiella variicola Stanley аптамер MTCC Для определения предела обнаружения бактерий в ГКР-спектроскопии исследовали бактериальные культуры E.coli с титром от 10 до 10^7 КОЕ/мл с золотыми нанозвездами или ГКР-мембранами. Предел обнаружения бактерий, окрашенных формазаном, с использованием золотых нанозвезд составляет около 100 КОЕ/мл, что совпадает с пределом обнаружения для ГКР-мембран с термическим напылением серебра. ГКР-мембраны с золотыми наночастицами дают кратно меньшие интенсивности спектра формазана. Определение устойчивости к антибиотику было проведено сравнением интенсивности спектра формазана в образцах с и без антибиотика для титров бактерий в диапазоне от 10^2 до 10^8 КОЕ/мл. В случае коллоидных золотых частиц при низких титрах бактерий тест не работал, поэтому дальнейшее исследование проводили при концентрации бактерий 10^6 КОЕ/мл для E.coli, S.aureus и K. pneumoniae. По результатам тестирования золотых нанозвезд в качестве ГКР-субстратов, показано, что их точность определения значительно ниже, чем МТТ-КР тест: 42% для МИК60%, 69% для МИК75% против 84% для МТТ-КР теста, что говорит о необходимости дальнейшей оптимизации методики. Для сравнения были проведены эксперименты по определению антибиотикоустойчивости с использованием ГКР-мембран. Эксперименты были проведены для E.coli, S.aureus и K. pneumoniae. ГКР-мембраны давали адекватный ответ и при высоких, и при низких титрах бактерий. Инкубация сверхнизкого титра бактерий E.coli ATCC25922 (50 КОЕ/мл) с 4 мкг/мл имипенема дало снижение, всего на 30%. Таким образом, хотя факт чувствительности бактерий к антибиотику в тесте с ГКР-мембранами установлен, требуется дополнительное исследования для подбора критериев определения МПК, зависящие от титра бактерий. Для высоких титров (10^6 КОЕ/мл) интенсивность спектров отдельных бактерий снижается при больших концентрациях антибиотика, различия в МПК составляли 4-8 раз. Итак, для низких титров бактерий необходимо увеличивать концентрацию антибиотика для согласования с традиционными методами. Проводилось исследование интенсивности ГКР сигнала нанометок от числа бактерий в культуре проводилось двумя способами: (а) измерение сигнала от смеси меток и бактерий сразу после адсорбции наночастиц; (б) цетрифугирование смеси с измерением сигнала от ресуспендированого осадка, содержащего только бактерии с адсорбированными на их поверхности нанометками. Оба метода продемонстрировали наличие линейной зависимости интенсивности пика ГКР нанометок от количества бактерий в исследуемых чистых культурах E.coli и S. aureus. Наилучшую воспроизводимость и высокий коэффициент R^2 наблюдали для золотых нанозвезд. Исследовано подавление ферментативной активности под действием антибиотиков с помощью резазуринового теста и ГКР-спектроскопии (в качестве ГКР-субстратов были использованы золотые нанозведы). При восстановлении резазурина образуется резоруфин, оба эти вещества имеют характерные пики в спектре ГКР. Исследование проведено для бактерий E. coli К-12 и S. aureus ATCC 25923 в титрах 10^6-10^7 КОЕ/мл под действием гентамицина, канамицина или цефалоспорина. МТТ и резазуриновый тест давали сходные значения МПК, при этом МТТ тест проводится быстрее, чем резазуриновый тест за счет меньшего времени инкубации индикатора с клетками перед измерением ГКР. Подготовлен обзор литературы по нанозимам, представляющим интересную альтернативу наночастицам для колориметрического определения. В обзоре суммированы данные о нанозимных колориметрических и люминесцентных биосенсорах для диагностики бактериальных патогенов.