Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Целью проводимых в течение первого года выполнения гранта работ было сравнение патологических последствий 24-часового воздействия различных провоспалительных пусковых факторов дисфункции эндотелия: 1) повышенной молярной концентрации глюкозы (7, 25 и 50 ммоль/л); 2) кальципротеиновых частиц (КПЧ-Ф, 5 мкг/мл); 3) мутагена митомицина С (500 нг/мл); 4) провоспалительных цитокинов интерлейкина-6 (IL-6, 100 нг/мл) и фактора некроза опухоли (TNF-α, 20 нг/мл); 5) конъюгированных с обезжиренным альбумином пальмитиновой и олеиновой кислот (ПК-БСА и ОК-БСА соответственно, 0,8 ммоль/л). С учетом исходной гетерогенности эндотелия эксперименты были проведены на четырех первичных линиях человека, представляющих различные направления эндотелиальной дифференцировки: 1) эндотелиальных клетках аортального клапана (ЭК-АК); 2) эндотелиальных клетках большой подкожной вены (ЭК-БПВ); 3) эндотелиальных клетках внутренней грудной артерии (ЭК-ВГА); 4) эндотелиальных клетках микрососудов подкожной жировой ткани (МСЭК). Всего в эксперимент было включено 12 культур, полученных от различных доноров (по 3 донора на каждую из указанных линий ЭК). Партнером (ИНЦ РАН) было выполнено протеомное профилирование физиологического и патологического секретома при воздействии провоспалительного пускового фактора дисфункции эндотелия (КПЧ). В результате выполненных в НИИ КПССЗ и ИНЦ РАН работ были получены следующие основные научные результаты: 1. Показано, что 24-часовое воздействие КПЧ-Ф, митомицина С, IL-6/TNF-α и ПК-БСА на ЭК человека приводит к устойчивому повышению экспрессии генов провоспалительных молекул клеточной адгезии (генов рецепторов эндотелиальных клеток для лейкоцитов VCAM1, ICAM1 и SELE), генов провоспалительных цитокинов (IL6, CXCL8, CCL2, CXCL1 и MIF) и генов транскрипционных факторов эндотелиально-мезенхимального перехода (SNAI1, SNAI2 и TWIST1). Наиболее выраженные провоспалительные изменения наблюдали при воздействии ПК-БСА. На основании полученных данных сделан вывод о том, что воздействие КПЧ-Ф, митомицина С, сочетания IL-6/TNF-α и ПК-БСА в указанной дозе вызывает патологические изменения генной экспрессии, соответствующие изолированной провоспалительной дисфункции эндотелия. 2. Не обнаружено стабильных различий между линиями ЭК в отношении их устойчивости к вышеуказанным пусковым факторам провоспалительной дисфункции эндотелия; выявлено, что вариабельность между различными линиями ЭК не превышает таковую между различными донорами внутри одной и той же линии. 3. Посредством дот-блот-профилирования выявлено, что наиболее чувствительными маркерами провоспалительной дисфункции эндотелия являются растворимая форма CD147/басигина и GM-CSF, выделение которых в культуральную среду повышалось соответственно в 15 из 20 (75%) и 13 из 20 (65%) случаев патологического воздействия. Наибольшей активностью в отношении индукции провоспалительной активации эндотелия в указанных дозах обладали ОК-БСА и ПК-БСА, несколько меньшей – митомицин С и IL-6/TNF-α, наименьшей – КПЧ-Ф. Показано, что наиболее выраженный цитокиновый ответ на воздействие КПЧ-Ф, ПК-БСА и ОК-БСА демонстрировали ЭК-БПВ, а на воздействие митомицина С и IL-6/TNF-α – ЭК-ВГА. Иерархия восприимчивости к провоспалительной активации была следующей: ЭК-БПВ (наиболее восприимчивые) – ЭК-ВГА – МСЭК – ЭК-АК (относительно устойчивые). 4. Определены основные молекулы, выделение которых повышается при провоспалительной дисфункции эндотелия: 1) провоспалительные цитокины (MIF, IL-6, IL-8, MCP-1/CCL2, GM-CSF, G-CSF, MIP-3α/CCL20, RANTES/CCL5, CXCL5, CXCL10); 2) растворимые формы эндотелиальных трансмембранных рецепторов (CD105/эндоглин, CD147/басигин, CD106/VCAM-1); 3) про-тромботические белки тромбоспондин-1 и растворимая форма рецептора урокиназы suPAR; 4) про-ангиогенные молекулы ангиогенин и ангиопоэтин-2. 5. Показано, что наиболее экспрессируемыми в физиологическом эндотелиальном секретоме категориями молекул являются белки, ответственные за: (1) гемостаз (≈ 38-40%), активацию и агрегацию тромбоцитов (≈ 31-35%); (2) врожденный иммунный ответ (≈ 35-37%), сигнальные пути цитокинов (≈ 20-22%) и интерлейкинов (≈ 17%); (3) очаговую адгезию (≈ 26%) и цитоскелет (≈ 18-22%); (4) коллагенсодержащие компоненты внеклеточного матрикса (≈ 24-30%), организацию внеклеточного матрикса (≈ 15-17%) и иные структурные компоненты внеклеточного матрикса (≈ 11%); (5) ангиогенез (≈ 11-15%) и сигнальный путь VEGF (≈ 11%). 6. Выявлено, что патологический эндотелиальный секретом характеризуется гипоэкспрессией биоинформатических категорий, относящихся к внеклеточному матриксу (в частности, к базальной мембране). Гипоэкспрессированные компоненты базальной мембраны включали остеонектин, перлекан, фибронектин, TIMP-1, ряд субъединиц ламинина (LAMB1, LAMA4, LAMC1), белок LOXL2, нидоген-1, фибриллин-1, агрин и субъединицы коллагена IV и VI типов (COL4A2 и COL6A1). Таким образом, патологический эндотелиальный секретом характеризуется снижением содержания компонентов внеклеточного матрикса. 7. Обнаружено, что патологический эндотелиальный секретом характеризуется стабильным повышением содержания растворимых форм рецепторов защиты от комплемента: протектина (CD59) и фактора ускорения распада комплемента (CD55). Выявлена устойчивая тенденция к стабильному (хотя и не достигающему дифференциального) повышению экспрессии ряда растворимых форм эндотелиальных рецепторов, выделяемых в культуральную среду при патологическом слущивании (шеддинге) или гибели эндотелиальных клеток. Наибольшая абсолютная экспрессия в патологическом эндотелиальном секретоме выявлена для растворимых форм эндотелиальных трансмембранных рецепторов CD31/PECAM1, CD146/MCAM, CD144/VE-кадгерина/CDH5, CD147/басигина, CD306/KDR/VEGFR2 и CD105/эндоглина, а также для вышеупомянутых растворимых форм рецепторов защиты от комплемента (CD59 и CD55). Показано, что из указанных молекул протектин (CD59) занимает второе место по абсолютной экспрессии и наиболее стабильно гиперэкспрессирован в патологическом эндотелиальном секретоме. Обнаружено, что относительно высокой (хотя и не достигающей дифференциальной) гиперэкспрессией в патологическом эндотелиальном секретоме характеризуются растворимые формы специфичных эндотелиальных рецепторов эфрина B1 и эфрина B2, эфринового рецептора B2, а также растворимая форма KDR/VEGFR2. 8. Учитывая относительную специфичность экспрессии CD146/MCAM, CD306/KDR/VEGFR2, CD106/VCAM-1, CD202b/TIE-2/TEK и CD147/басигина для эндотелиальных клеток, а также высокую относительную гиперэкспрессию растворимых форм рецепторов защиты от комплемента (CD59 и CD55) при патологическом воздействии пусковых факторов провоспалительной дисфункции эндотелия, можно предположить именно эти белки в качестве наиболее чувствительных, специфичных и стабильных маркеров провоспалительной дисфункции эндотелия.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Целью проводимых в течение второго года выполнения гранта работ было сравнение патологических последствий 24-часового воздействия пусковых факторов: - провоспалительной активации эндотелия: мочевины, липополисахарида (ЛПС) или фактора некроза опухоли (TNFα) в сочетании с повышенным содержанием CO2 в атмосфере (15%); - метаболической дисфункции эндотелия, вызываемой заменой специализированной бессывороточной среды EndoLife для поддержания жизнеспособности эндотелиальных клеток на обедненную питательными веществами базальную среду Игла (BME) в сочетании с повышенным содержанием CO2 в атмосфере (15%) для сочетания нехватки питательных веществ с метаболическим ацидозом, что наблюдается при ишемических состояниях; - протромботической активации эндотелия, то есть S1-субъединицы Spike-белка SARS-CoV-2 (S1P); - вазоспастической дисфункции эндотелия, то есть ингибиторов эндотелиальной NO-синтазы L-NAME, L-NIO и хлорида дифенилениодония (DPI). С учетом исходной гетерогенности эндотелия эксперименты были проведены на четырех первичных линиях человека, представляющих различные направления эндотелиальной дифференцировки: 1) эндотелиальных клетках аортального клапана (ЭК-АК); 2) эндотелиальных клетках большой подкожной вены (ЭК-БПВ); 3) эндотелиальных клетках внутренней грудной артерии (ЭК-ВГА); 4) эндотелиальных клетках микрососудов подкожной жировой ткани (МСЭК). В соответствии с планом были получены культуры ЭК-БПВ, ЭК-ВГА и МСЭК от одних и тех же пациентов с ишемической болезнью сердца, перенесших коронарное шунтирование на четырех последовательных пассажах, из которых на каждом пассаже была выделена РНК. После выделения РНК партнером (ИНЦ РАН) было проведено полнотранскриптомное секвенирование всех образцов с дальнейшим многомерным анализом для сравнения относительного расстояния между различными направлениями дифференцировки ЭК (ЭК-БПВ, ЭК-ВГА и МСЭК), различными донорами и различными пассажами. Также в ИНЦ РАН было выполнено сравнение базальной провоспалительной активности ЭК-АК, ЭК-БПВ, ЭК-ВГА и МСЭК. В результате выполненных в НИИ КПССЗ и ИНЦ РАН работ были получены следующие основные научные результаты: 1. Показано, что 24-часовое воздействие TNFα и инкубация в обедненной питательными веществами среде BME в сочетании с повышением содержания CO2 в атмосфере до 15%, а также добавление DPI к ЭК-АК, ЭК-БПВ, ЭК-ВГА и МСЭК вызывает изолированную провоспалительную дисфункцию эндотелия. Добавление мочевины, ЛПС, S1P, L-NAME и L-NIO к вышеуказанным культурам первичных ЭК на 24 часа провоспалительной дисфункции эндотелия не вызывало. 2. На основании результатов анализа генной экспрессии в дисфункциональных ЭК-АК, ЭК-БПВ, ЭК-ВГА и МСЭК были отобраны гены провоспалительных молекул клеточной адгезии (VCAM1, ICAM1, SELE) и провоспалительных цитокинов (IL1A, IL6, CXCL1, CXCL5, CXCL6, CXCL8, CCL2, CCL5 и CCL20), наиболее чувствительно и специфично отражающих провоспалительную активацию эндотелия. 3. По результатам иммуноферментного анализа концентрации провоспалительных цитокинов в культуральной среде от дисфункциональных ЭК-АК, ЭК-БПВ, ЭК-ВГА и МСЭК было выявлено, что наиболее чувствительными цитокиновыми маркерами дисфункции эндотелия на клеточных культурах являются IL-6, IL-8 и GM-CSF. Наиболее эффективными пусковыми факторами провоспалительной активации эндотелия были КПЧ, MMC, DPI, TNFα и инкубация в обедненной питательными веществами среде BME. 4. В результате иммуноферментного анализа концентрации VCAM-1/CD106, VEGFR2/KDR/CD309, ENG/CD105, JAM1/F11R/CD321, PECAM1/CD31, VE-кадгерина/CDH5/CD144, MCAM/CD146, BSG/CD147, Tie-2/TEK/CD202b, ITGA2, ITGA5, EFNB1, EFNB2, CD55 и CD59 в вышеуказанной культуральной среде выявлено, что наиболее чувствительными и специфичными маркерами дисфункции эндотелия являются VCAM1/CD106, VEGFR2/KDR/CD309 и ENG/CD105. 5. Методом дот-блоттинга продемонстрировано, что при 24-часовом воздействии TNFα или нехватки питательных веществ в сочетании с повышением содержания CO2 в атмосфере до 15%, S1P и DPI на ЭК-АК, ЭК-БПВ, ЭК-ВГА и МСЭК в культуральной среде повышается концентрация провоспалительных цитокинов IL-6, GM-CSF, RANTES/CCL5, Groα/CXCL1, PTX3, MIF и растворимой формы ENG/CD105. Реакция ЭК на провоспалительные стимулы характеризовалась выраженной гетерогенностью, при этом ЭК-ВГА в среднем имели наиболее высокую устойчивость к патологическому воздействию. 6. Посредством биоинформатического анализа качественного и количественного состава секретома интактных и дисфункциональных ЭК коронарной артерии (ЭК-КА) и ЭК-ВГА выявлено, что при дисфункции эндотелия в культуральной среде повышается содержание растворимых форм рецепторных маркеров эндотелиального фенотипа PTPRB, ITGA5, EPHB2, JAM1/F11R/CD321, TIE2/TEK/CD202b, CLEC14A, BSG/CD147, VEGFR2/KDR/CD309, ENG/CD105, ITGA2, MCAM/CD146, ITGB1, EDF1, EPHB4 и ICAM1. 7. При анализе компонентов эндотелиальной базальной мембраны в культуральной среде от ЭК-АК, МСЭК, ЭК-КА и ЭК-ВГА независимо от пускового фактора дисфункции эндотелия было выявлено стабильное повышение содержания растворимой формы мембрансвязанного кальций-связывающего белка аннексина А2. Несмотря на значительное количество белков субэндотелиального внеклеточного матрикса, молекул сигнальных путей ангиогенеза и сигнальных путей гемостаза, а также на определенное количество молекул сигнальных путей биосинтеза NO в культуральной среде от ЭК-КА и ЭК-ВГА, экспрессия ни одной из них не была стабильно повышена при индуцированной in vitro дисфункции эндотелия. 8. На культурах от ЭК-БПВ, ЭК-ВГА и МСЭК от одних и тех же пациентов с ишемической болезнью сердца, перенесших коронарное шунтирование на четырех последовательных пассажах при помощи полнотранскриптомного секвенирования показаны: 1) существенная молекулярная гетерогенность ЭК-БПВ, ЭК-ВГА и МСЭК; 2) сохранение данной гетерогенности на протяжении не менее чем четырех пассажей при культивировании в статических условиях, что указывает на отсутствие спонтанной дедифференцировки ЭК в процессе культивирования; 3) стабильная гетерогенность между ЭК, полученными от различных доноров. Полученные данные указывали на то, что в гетерогенность ЭК основной вклад (в порядке убывания) вносят: (1) наличие или отсутствие, а также степень выраженности дисфункции эндотелия; (2) исходное направление их дифференцировки; (3) особенности конкретного донора; в то же время в процессе культивирования ЭК их гетерогенность изменяется лишь несущественно. 9. По результатам сравнительного анализа базальной провоспалительной активности ЭК-АК, ЭК-БПВ, ЭК-ВГА и МСЭК выявлена принципиальная схожесть спектра провоспалительных цитокинов, выделяемых в культуральную среду всеми указанными типами ЭК. Из всех указанных типов ЭК наиболее высокая базальная экспрессия генов провоспалительных молекул клеточной адгезии и провоспалительных цитокинов наблюдалась в ЭК-ВГА.