Аннотация результатов, полученных в 2025 году
При уменьшении концентрации липосом из 100% DOPS в буфере 100 mM NaCl, 50 mM MES, титрованном до pH 7 посредством KOH картина формирования бислоя меняется от полностью сформированного бислоя (100% заполнение подложки) для концентраций 1 г/л и 0.2 г/л до появления дыр с заполнением подложки бислоем на 99.8%, 94.3%, 72.6% для концентраций 0.05 г/л, 0.03 г/л и 0.015 г/л соответственно (рис.1). Для липосом из 100% DOPC в буфере 100 mM NaCl, 50 mM MES, титрованном до pH 7 посредством KOH бислой на слюде не формируется ни при какой концентрации липосом. По сравнению со 100% DOPS, слияние липосом из 30 % DOPS 70% DOPC приводит к менее эффективному формированию бислоя: 99.8% против 52.4% заполнения подложки для фиксированной концентрации липосом в 0.05 г/л, а также фиксированном времени адсорбции в 10 минут. Выявлено, что при добавлении 70% DOPC к DOPS образуются домены высотой 2-2.5 нм. Форма доменов различна для разных концентраций липосом, используемых для формирования бислоя: при повышении концентрации от 0.1 г/л до 0.2 г/л (рис. 2 b,c) протяженные извилистые домены сужаются, переходя в округлую форму (рис. 2 d,e for 0.3 г/л и 0.4 г/л) и далее в маленькие точки (вставка с zoom-in на рис.2f). При варьировании соотношения DOPC и DOPS происходит изменение формы доменов. Умеренное снижение процентного содержания DOPC в липосомах приводит к увеличению площади доменов вплоть до половины площади подложки (для 90% DOPC) а также к появлению дыр внутри доменов. Установлено, что дальнейшее повышение содержания DOPC в смеси липидов привело к отсутствию формирования бислоя. Липосомы с составом 95% DOPC 5% DOPS при взаимодействии со слюдой формируют только небольшие отдельные патчи суммарной площадью 3.6% от общей площади подложки (таблица 2). Установлено, что при приготовлении липосом из 100% DOPS в деионизированной воде, дальнейшем нанесении на подложку и сканировании не адсорбируются ни отдельные липосомы на подложке, ни патчи, и не формируется бислой. Формирование бислоя из 100% DOPS липосом на слюде возможно и в отсутствие двухвалентных ионов, но при наличии в буфере MES и K+, а также достаточно высокой ионной силы >100 mM NaCl. Выявлена роль ионов К и Na при исследовании формирование липосом из 90% DOPC 10% DOPS в 1) деионизированной воде и 2) таком же буфере (100 mM NaCl, 50 mM MES), но титрованном до pH 7 добавлением NaOH вместо KOH. Различные концентрации от очень низких 0.04 г/л и плоть до 1 г/л с одинаковым временем адсорбции 10 минут (рис.4 a,b) приводят к схожим картинам лишь небольшого числа слабо удерживаемых на слюде липосом с отсутствием формирования патчей и отсутствием слияния их в бислой. Липосомы из 100% DOPC, нанесенные из раствора как в деионизированной воде, так и буфера 100 mM NaCl, 50 mM MES, титрованном до pH 7 добавлением NaOH в концентрации 0.25 г/л на слюду, в течение 10 минут формируют бислой со 100% заполнением подложки. При замене 100 mM NaCl на 100 mM KCl (с теми же 50 mM MES и титрованием NaOH) в буфере для приготовления мембраны на подложке исследованы составы 90% DOPC 10% DOPS (рис. 4 c,d) и 70% DOPC 30% DOPS (рис. 4 h). В экспериментах обнаружены домены, очень схожие c теми, что были для буфера с зеркальным составом 100 mM NaCl 50 mM MES, но титрованным KOH. Липосомы из 100% DOPC не формируют бислой на слюде. Разброс содержания MES на порядок приводит к умеренному изменению количества доменов и их суммарно занимаемой площади на подложке, в то же время исключение ионов Na из буфера никак не сказывается на морфологии доменов. На основании результатов экспериментов и анализа литературных данных, выдвинута гипотеза, что ионы калия служат связующим мостом между слюдой и отрицательно заряженной сульфоновой группой MES. MES, находясь в pH 7 преимущественно в депротонированном состоянии и представляя собой цвиттерион, может с одного конца взаимодействовать с K+, а с другого с DOPS. Установлено, что при закислении буфера до значений pH 5.6 и ниже на бислое, сформированном из липосом с составом 90% DOPC 10% DOPS, приготовленных в буфере 100 mM NaCl, 50 mM MES (+KOH), домены отсутствуют. Выявлено, что липосомы из 100% DOPC формируют бислой в условии нанесения из буфера 100 mM NaCl, 50 mM MES, титрованном KOH до pH 4.6: в кислой среде MES протонируется, и поэтому не связывается со слюдой даже в присутствии ионов K+, таким образом DOPC может напрямую контактировать со слюдой и формировать бислой. 10 минут экспозиции 100% DOPC липосом концентрацией 1 г/л и 0.1 г/л приводит к формированию бислоя с заполнением подложки на 100% и 50% соответственно. Исследованы липосомы составом 90% DOPC 10% DOPS предмет формирования бислоя в отсутствие ионов K+ в буфере 100 mM NaCl, 50 mM Hepes титрованном до pH 7 с использованием HCl. При нанесении на слюду из раствора с различной концентрацией от очень низкой 0.004 г/л до 1 г/л в течение 10 минут бислой не формируется. C уменьшением содержания DOPS c 10% до 5% картина меняется: для концентраций 0.5 г/л и 1 г/л и времени адсорбции 10 минут площадь заполнения подложки бислоем составляет 60% и 98%, соответственно. Домены отсутствуют, поверхность бислоя ровная. Липосомы из 100% DOPC концентрацией 1 г/л при адсорбции на подложке в течение 10 минут также формируют бислой на слюде со 100% заполнением. Для липосом 90% DOPC 10% DOPS с повышением ионной силы вплоть до 500 mM NaCl бислой эффективно формируется в буфере с Hepes и при низких концентрациях липосом 0.05 г/л и 0.1 г/л: адсорбция в течение 10 минут приводит к заполнению подложки на 50% и 100% соответственно (рис. 6 a,b). Формирование бислоя и его морфология исследованы для буфера с Hepes содержащего K+: 100 mM KCl, 50 mM HEPES. 100% DOPC не дают бислой, тогда как добавление в состав липосом DOPS приводит к появлению бислоя на подложке: таблица 3 представляет собой значения концентраций липосом, достаточных для 100% заполнения подложки бислоем при адсорбции в течении 10 минут, для различных значений процентного содержания DOPS в составе липосом. В целом бислой формируется при схожих условиях, что и для буфера MES, однако без доменов, что можно объяснить электростатической природой при заданном pH 7. Бислой в буфере с трис из 100% DOPC и 100% DOPS липосом не формируется на слюде ни при каких концентрациях липосом, времени адсорбции, а также добавлении с буфер ионов Na и K, сдвигах pH относительно pKa. Объяснением может служить свойство Триса формировать на поверхности слюды аморфного слоя толщиной в несколько молекул без какой-либо упорядоченности, в то время как MES и Hepes формируют эпитаксиальный слой соответствующий нижележащей решетке слюды.