Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Ионы кальция (Ca²⁺) регулируют широкий спектр физиологических процессов в клетках человека и других млекопитающих, таких как внутриклеточная передача сигнала от поверхностных рецепторов, сокращение сердечной, скелетной и гладкой мускулатуры, синаптическая передача, иммунные реакции, а также баланс между выживанием и гибелью клеток. Нарушение кальциевого сигналлинга связаны с множеством патологических состояний. В патогенезе неврологических расстройств нарушение гомеостаза Ca²⁺ способствует эксайтотоксичности, накоплению бета-амилоидов и синаптической дисфункции. В раковых клетках ионы Ca²⁺ влияют на пролиферацию опухоли, миграцию и устойчивость к апоптозу. При сердечно-сосудистой дисфункции нарушение Ca²⁺-сигналинга в кардиомиоцитах приводит к аритмиям и сердечной недостаточности, а дефекты Ca²⁺-сигналинга в иммунных клетках - к иммунодефицитам и аутоиммунным заболеваниям. Понимание молекулярных механизмов динамики ионов Ca²⁺ в различных типах клеток является важнейшим звеном в прояснении механизмов возникновения данных патологий и поиске потенциальных терапевтических стратегий. Метод оптогенетики, изначально разработанный для управления возбудимыми клетками с помощью света, представляет собой возможность изменять концентрации ионов в клетке с помощью экспрессии на плазматической мембране светочувствительных белков семейства микробных родопсинов. В предыдущем исследовании нами был разработан новый подход к использованию метода оптогенетики для высокоточного контроля рН цитозоля клеток человека с помощью экспрессии в плазматической мембране клеток родопсинов - протонных помп. Попутно была обнаружена взаимосвязь между оптогенетическим изменением рН цитозоля и концентрацией Ca²⁺ в клетке. Данный проект направлен на всестороннее изучение обнаруженного нами явления - изменения концентрации кальция в цитозоле клеток при оптогенетическом защелачивании цитозоля. Основной целью данного проекта является прояснение механизма гибели клеток при оптогенетическом защелачивании цитозоля, которое также было показано ранее в литературе. В ходе работы над проектом были получены необходимые генетические конструкции и отработана методика наблюдения динамики кальция в цитозоле, ЭПР, митохондриях клеток человека при помощи флуоресцентных белковых сенсоров в реальном времени во время оптогенетического эксперимента. Само явление оптогенетического изменения концентрации кальция было показано нами на широком диапазоне клеточных линий, в то числе на первичных культурах астроцитов, а также на культурах иммунных клеток. В ходе исследования также было показано изменение концентрации кальция в митохондриях клеток а также изучено воздействие на уровень кальция освещения светодиодом различной длительности, повторяющегося освещение, освещения в импульсном режиме. Также в ходе работы над проектом было обнаружено повышение концентрации активных форм кислорода при длительном оптогенетическом защелачивании цитозоля. Нарастание количества активных форм кислорода было показано в митохондриях и цитозоле клеток. Данный результат особенно важен, т.к. лавинообразное нарастание концентрации активных форм кислорода может являться триггером или эффекторным механизмом процесса клеточной гибели. Разработанный в ходе работы над проектом оптогенетический подход к контролю рН цитозоля и опосредованному контролю концентрации кальция и активных форм кислорода является важным для понимания взаимосвязи этих базовых физиологических параметров в здоровой клетке, а также роли нарушения баланса этих параметров в патогенезе сердечно-сосудистых, нейродегенеративных, аутоиммунных заболеваний, иммунодефицитов и рака.

Аннотация результатов, полученных в 2026 году
рН цитозоля клетки - важнейший физиологический параметр, тесно связанный с рН органелл и внеклеточной среды. Дифференцированные клетки человека имеют внутриклеточный рН около 7.2, при этом рН межклеточной среды составляет 7.4. Стабильное защелачивание цитозоля (более 7.4) при активном аэробном гликолизе типично для раковых клеток (эффект Варбурга). При этом образующаяся кислота выбрасывается наружу клетки, закисляя межклеточную среду (рН менее 7.1) . Показана связь между повышенным внутриклеточным рН и многими особенностями раковых клеток, такими как усиленная пролиферация, резистентность к апоптозу, способность к метастазированию и др. Недавно была показана непосредственная активация экспрессии циклина D1 при повышении внутриклеточного рН. Также, процессы миграции многих клеток, в том числе метастазирующих раковых клеток, требуют повышенного рН цитозоля. В частности, активность кофилина - белка, необходимого для сборки актиновых филаментов, в метастазирующих клетках, повышается при увеличении рН. Также, подобное раковым клеткам защелачивание цитозоля (вместе с аэробным гликолизом) наблюдается в клетках хвостовой почки при эмбриогенезе позвоночных, где под действием защелачивания происходит активация WNT-сигналлинга. Метод оптогенетики представляет собой уникальный инструмент, позволяющий контролировать физиологические процессы в клетках с помощью света с высоким временным и пространственным разрешением. Используемые в проекте микробные родопсины-ионные помпы позволяют напрямую контролировать поток ионов через мембраны, воздействуя светом на важнейшие параметры гомеостаза клеток, такие как рН и концентрация ионов кальция. Применение методов и подходов оптогенетики к невозбудимым клеткам позволяет выявить особенности регуляции ионного гомеостаза, недоступные для изучения другими методами, а также обнаружить отличия между клетками в норме и при патологии (например, в раковых клетках). Недавно было показано, что оптогенетическое изменения рН цитозоля в сторону защелачивания способно приводить к запуску клеточной гибели по механизму апоптоза , убийству раковых клеток и уменьшению раковых опухолей у мышей. В данном проекте основной задачей было исследование роли повышения концентрациии кальция в цитозоле клетки при оптогенетическом защелачивании в индукции апоптоза и отделить её от роли изменения рН в этих процессах. В ходе выполнения проекта было обнаружено падение АТФ (измереное с помощью генетически-кодируемого флуоресцентного сенсора ATeam1.03) при оптогенетическом защелачивании цитозоля в клетках HeLa, происходящее как в присутствии кальция, так и в отсутствие кальция в цитозоле и во внеклеточной среде. Также было обнаружено изменение морфологических и физиологических параметров митохондрий при оптогенетическом защелачивании. В частности, происходила фрагментация митохондрий как в присутствии кальция, так и в буфере без него. Особый интерес представляет также обнаруженное повышение мембранного потенциала митохондрий, сопровождающееся последующим его падением. Было также показано, в том числе с использованием генетически-кодируемых флуоресцентных сенсоров активности каспаз (pCas3), что апоптоз происходит вследствие оптогенетического защелачивания цитозоля даже в отсутствие внеклеточного кальция. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что именно изменение рН цитозоля служит основным триггером запуска апоптоза при оптогенетическом защелачивании цитозоля клеток человека.