Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Штамм Escherichia coli HS является одним из наиболее распространённых представителей нормального микробиома кишечника человека. Его конкурентное преимущество в колонизации кишечника, вероятно, обусловлено, в том числе, высокой устойчивостью к бактериофагам. До настоящего времени в литературе не были описаны ДНК-содержащие бактериофаги, способные инфицировать этот штамм, несмотря на то что ДНК-фаги составляют около 95% популяции фагов кишечника. Подобная устойчивость может объясняться как особенностями клеточной стенки и отсутствием соответствующих вирусных рецепторов, так и наличием систем противовирусной защиты. В рамках проекта был отсеквенирован геном лабораторного варианта штамма HS. Сопоставление полученной последовательности с опубликованными данными по экспрессии генов позволило предсказать наличие двух полноценных профагов (P2- и P22-подобного), а также двух потенциально новых систем противовирусного иммунитета. С помощью проведённого нами анализа 5′RACE были определены промоторы этих систем. Первая система, состоящая из трёх генов, гомологична компонентам BREX (BacteRiophage EXclusion) и, согласно HHpred-анализу, кодирует BrxC-подобную АТФазу, ДНК-метилтрансферазу и мембранный белок неизвестной функции. Вторая система локализуется в так называемом "горячем" локусе P2-подобного профага и включает четыре гена, условно обозначенные как X1–X4. Гены Х1 и Х2 гомологичны SOS-регулируемым генам tum и dinI соответственно. По результатам предсказания структуры (AlphaFold) и анализа HMM-профилей, белки X3 и X4 предположительно имеют мембранную локализацию. В рамках проекта мы заклонировали данные гены в вектор pBR322 под контролем их собственных промоторов и протестированы в штамме E. coli BW25113 на предмет антивирусной активности против широкого спектра бактериофагов. Полученные результаты показали, что исследуемые белки обеспечивают защиту от фагов, использующих различные рецепторы, причём особый интерес представляют белки X3 и X4, предположительно блокирующие инъекцию фаговой ДНК. Эта гипотеза будет проверена в дальнейших экспериментах. Для детального изучения этих белков были сконструированы плазмиды, кодирующие X3 и X4 со strep-тагом для проведения pulldown-анализов во время фаговой инфекции. Также получены варианты вектора pSci-dCas9 для точечного внесения стоп-кодонов в исследуемые гены штамма HS. В течение первого года реализации проекта также были исследованы активности P2- и P22-подобных профагов HS. При индукции SOS-ответа митомицином С наблюдалось увеличение копийности и выход P22-профага из клеток, тогда как P2-подобный профаг оставался неактивным. Этот результат противоречит ранее полученным данным транскриптомного анализа, согласно которым P2-профаг, помимо предсказанных иммунных локусов, содержит гены, потенциально участвующие в его самовырезании и конкурентном ингибировании SOS-зависимых профагов. Планируется детально исследовать роль LexA-регулируемого локуса в регуляции P2-профага в конкретном штамме, а также механизмы его взаимодействия с профагом P22. В ходе работы были секвенированы и охарактеризованы ДНК-содержащие бактериофаги, способные инфицировать штамм E. coli HS, ранее выделенные в лаборатории д.б.н. А. В. Летарова (ФИЦ «Биотехнологии» РАН). Установлено, что эти фаги относятся к семействам Queuoviridae, Lederbergviridae и Ackermannviridae (HS1, HS2 и HS3 соответственно), что также было подтверждено методом просвечивающей электронной микроскопии. Фаг HS2 демонстрирует высокую степень гомологии с P22-подобным профагом HS и чувствительность к BREX-системе, присутствующей в геноме штамма. В то же время фаг HS1 не способен инфицировать штамм HSΔBREX, в геноме которого, помимо BREX, отсутствует участок локуса, ответственного за синтез О-антигенов, что, вероятно, обусловливает потерю рецепторов, необходимых для адсорбции фага.

Аннотация результатов, полученных в 2026 году
В рамках проекта в отчетном периоде был проведен углубленный анализ молекулярных механизмов, обеспечивающих повышенную устойчивость комменсального штамма Escherichia coli HS к заражению ДНК-содержащими бактериофагами. Данный штамм является моделью «истинного комменсала» здорового кишечника человека и широко используется в исследованиях микробиома, однако причины его резистентности к фагам оставались неизвестными. В ходе работы впервые охарактеризованы три бактериофага, способные инфицировать E. coli HS, — ϕHS1, ϕHS2 и ϕHS3. Для каждого из них определены морфология, геномная последовательность, жизненный цикл и идентифицированы клеточные рецепторы. Установлено, что ϕHS1 распознает O9-антиген на поверхности бактерии, тогда как ϕHS2 и ϕHS3 нацелены на капсульный полисахарид. Были выявлены редкие модификации ДНК у фагов ϕHS1 (замена гуанозина на dPreQ₀, ~29,5% остатков) и ϕHS2 (замена тимидина на 5-NeOmdU), которые защищают геномы фагов от расщепления бактериальными рестриктазами. Изучено взаимодействие фагов с эндогенной системой иммунитета HS штамма — BREX. Показано, что BREX эффективно подавляет репликацию ϕHS2 и ϕHS3, но не влияет на ϕHS1. Ключевым открытием стало обнаружение того, что капсула HS не является типичной для E. coli, а гомологична капсуле K47 Klebsiella pneumoniae и произошла в результате горизонтального переноса. Такая уникальная поверхностная архитектура (сочетание O9-антигена и Klebsiella-подобной капсулы) обнаружена только у штамма HS и одного родственного изолята Shigella flexneri. Экспериментально подтверждено, что ϕHS2 и ϕHS3, чьи рецептор-связывающие белки кластеризуются с таковыми у Klebsiella-специфичных фагов, способны также инфицировать K. pneumoniae с капсулой K47. Таким образом, широкая устойчивость E. coli HS к колифагам объясняется не только активными системами иммунитета, но в значительной степени - маскирующей ролью чужеродной капсулы, которая недоступна для распознавания большинством кишечных фагов. Кроме того, в ходе работы охарактеризованы два эндогенных профага штамма HS: P22-подобный ϕHS4 и P2-подобный DuoHS. Продемонстрирована их асимметричная индукция и впервые для данного штамма показано явление латеральной трансдукции, опосредованное ϕHS4, при котором в фаговые капсиды упаковываются крупные фрагменты бактериальной хромосомы, включая гены иммунных систем. Полученные результаты раскрывают механизмы коэволюции бактерий и фагов в кишечном микробиоме человека, объясняют феномен высокой фагорезистентности комменсального штамма HS и создают основу для разработки новых подходов к фаготерапии.