Создание репортерной конструкции для поиска антибиотиков, ингибиторов бактериальной транскрипции

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 24-74-00139

НазваниеСоздание репортерной конструкции для поиска антибиотиков, ингибиторов бактериальной транскрипции

Руководитель Лукьянов Дмитрий Александрович, Кандидат химических наук

Организация финансирования, регион Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования «Сколковский институт науки и технологий» , г Москва

Конкурс №97 - Конкурс 2024 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые слова Антибиотики. Ингибиторы транскрипции. Поиск антибиотиков.

Код ГРНТИ31.23.25

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Пандемия короновируса 2020 года показала, незащищенность человечества по отношению к патогенам. Антибиотики были открыты еще в начале прошлого века, однако до сих пор бактериальные заболевания являются одной из серьезнейших угроз для современной системы здравоохранения. По данным Всемирной Организации Здравоохранения к 2050 смертность от резистентных форм бактерий вырастет более чем в 10 раз, при этом еще в 2015 году в Российской Федерации более 40% инфекций были вызваны бактериями устойчивыми к антибиотикам. Таким образом задача поиска новых антибиотиков остро стоит перед современной наукой. В ходе поиска соединений с антибактериальной активностью исследователи не редко сталкиваются с проблемой переоткрытия антибиотиков, которые были уже исследованы ранее. В некоторых случаях процесс идентификации активного соединения может занять продолжительное время и ускорение этого процесса может существенно увеличить эффективность поиска новых соединений с антибиотической активностью. Одним из ключей в ходе дерепликации (идентификации известных соединений в природных образцах) является понимание механизма действия активного соединения. Установление механизма действия активного компонента из экстракта, может быть, реализовано путем проведения большого набора биохимических тестов. Другим подходом является использование репортерных штаммов позволяющих детектировать определенный механизм действия антибиотика. В ходе данного исследования будет разработана репортерная система, позволяющая детектировать различные механизмы действия антибиотиков, в частности, ингибирования транскрипции в клетках бактерий. Далее с использованием данной системы будет произведен широкомасштабный поиск антибиотиков среди природных образцов, продуцентов рода Streptomyces sp., и будут отобраны объекты для дальнейшего более детального исследования их механизмов действия. Работа с новыми ингибиторами биосинтеза РНК может иметь как прикладную пользу в виде нового потенциального антимикробного препарата, так и может быть полезна в теоретических исследованиях, связанных с функционированием такого важного ферментативного комплекса как РНК-полимераза.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Для поиска генов, уровень экспрессии которых повышается после обработки антибиотиками, ингибирующими бактериальную РНК-полимеразу (в первую очередь, рифампицин), были проанализированы транскриптомные данные (NCBI: PRJNA924329, PRJNA889731). Основное внимание уделялось E. coli K12, обработанной тремя антибиотиками с разными механизмами действия, а основной нашей задачей на данном этапе являлось обнаружение уникальных генов, уровень экспрессии которых заметно увеличивается после обработки именно рифампицином. Данные RNA-seq картировали на геном, подсчитывали совпадения с использованием программы FeatureCounts и с помощью программы DESeq2 был проведён подсчёт дифференциальной экспрессии. Выделено 11 генов-кандидатов, включая b0121 (спермидин синтаза). Эксперименты qRT-PCR подтвердили, что только спермидин синтаза стабильно активируется рифампицином (но не другими антибиотиками). Тесты проводили с разными концентрациями (0.5X, 2X, 5X МИК) антибиотиков, таких как рифампицин, левофлоксацин, тетрациклин, ампициллин и колистин. В результате была показана специфичность ответа. Для создания репортёрной системы на основе промотора спермидин синтазы модифицировали плазмиду pDualRep2, заменив Katushka2S на EYFP или EGFP (предпочтение отдано EYFP из-за более яркого сигнала). Затем в эту плазмиду встроили три варианта промотора спермедин синтазы (369 п.н., 430 п.р. и 500 п.н.). В ходе следующего этапа будет проходить валидация полученных конструкций с разными антибиотиками, ингибиторами биосинтеза РНК.

Публикации

1. Васильченко А.С., Лукьянов Д.А., Дибарян Д.С., Усачев К.С., Почвина Д.В., Талдаев А., Никандрова А.А., Имамутдинова А.Н., Гараева Н.С., Бикмуллин А.Г., Клочкова Е.А., Русланов А.Л., Ромашнин Д.Д., Лузгина Н.Г., Остерман И.А., Сергиев П.В. и Тесля А.В. Macrolactin A Is an Inhibitor of Protein Biosynthesis in Bacteria Biochimie, Available online 16 January 2025 (год публикации - 2025)
https://doi.org/10.1016/j.biochi.2025.01.003