Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В 2025 году в рамках проекта РНФ № 24-74-10087 «Технологии автономной биолюминесценции, не чувствительные к активности метаболизма» были достигнуты значимые результаты в области создания новых рациометрических биолюминесцентных систем для использования в растительных и микробных клетках. Автономная биолюминесценция — это свечение, не требующее добавления субстрата извне, поскольку его синтез происходит in vivo. Такая технология является перспективной для неинвазивной визуализации физиологических процессов в живых организмах, включая растения, животных и микроорганизмы. Однако существующие системы автолюминесценции существенно зависят от метаболической активности клеток, что ограничивает возможность количественного анализа экспрессии генов. Цель проекта — разработка автолюминесцентных систем, сигнал которых минимально зависит от вариаций клеточного метаболизма. Для достижения этой цели в отчетном периоде были выполнены следующие ключевые работы: 1. Разработка концепции двухцветного рациометрического репортера. Создана стратегия, при которой используются две люциферазы, работающие на одном субстрате: одна под контролем репортерного (регулируемого) промотора, вторая — под конститутивным (постоянно активным). Это позволяет оценивать изменения экспрессии исследуемого гена независимо от колебаний метаболической активности. 2. Получение новых вариантов люциферазы с красным спектром люминесценции. С учетом ограничений стандартной грибной люциферазы, основной задачей первого этапа стало создание модифицированных вариантов, испускающих свет в красной и дальнекрасной области спектра. Реализовано два подхода: – Таргетная вставка флуоресцентных белков (mKate2, mScarlet, tdTomato) в заранее определенные участки люциферазы на основе библиотеки с 17-аминокислотными вставками; – Нетаргетная вставка флуоресцентных доменов при помощи транспозонной технологии Mu-BsaI, обеспечивающей случайное встраивание с последующей заменой транспозона на целевую вставку. Эти подходы позволили создать обширную библиотеку химерных белков с потенциалом BRET (биолюминесцентного резонансного переноса энергии), что является ключевым элементом в смещении спектра в красную область. 3. Разработка и синтез библиотеки линкеров. Создана коллекция линкеров различной длины и гибкости — от гибких глицин-сериновых повторов до жестких α-спиралей и природных последовательностей. Подбор линкеров необходим для обеспечения правильной ориентации доменов люциферазы и флуоресцентного белка, что критично для эффективности переноса энергии и стабильности сигнала. 4. Оптимизация генетических конструкций для экспрессии в растениях. Все вставки и кодирующие последовательности были оптимизированы для экспрессии в растениях Nicotiana benthamiana и N. tabacum. Конструкции собраны по модульной технологии Golden Gate, что обеспечило удобство создания и валидации библиотек. 5. Создание универсального вектора экспрессии. Разработан вектор, позволяющий экспрессию генов как в растениях, так и в дрожжах Saccharomyces cerevisiae. Это дало возможность быстрого тестирования эффективности конструкций в двух различных моделях. Особое внимание было уделено использованию синтетического промотора pMinSyn108, функциональность которого подтверждена в обоих организмах. 6. Предварительная функциональная проверка химерных конструкций. Проведен первичный скрининг конструкций с вставками флуоресцентных белков. Наиболее эффективные варианты — белки-фьюзы с tdTomato и mKate2 — показали наибольшее соотношение красного к зеленому свечению при минимальной потере яркости. Эти варианты будут использованы для дальнейшего подбора линкеров и оптимизации чувствительности системы. Все задачи, запланированные на первый год проекта, были успешно выполнены. Полученные результаты заложили прочную экспериментальную основу для следующего этапа работ, включающего отбор наилучших конструкций, оптимизацию линкеров и создание полноценных рациометрических биолюминесцентных репортеров, устойчивых к метаболическим флуктуациям. Эти разработки имеют потенциал широкого применения в сельском хозяйстве, биомедицине и экологическом мониторинге.