ПОЛУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР IN VITRO РЕЛИКТОВЫХ И ИСЧЕЗАЮЩИХ ГОЛОСЕМЕННЫХ РАСТЕНИЙ РОДА Sequoia И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ИХ МЕТАБОЛИТОВ

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 24-76-00070

НазваниеПОЛУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР IN VITRO РЕЛИКТОВЫХ И ИСЧЕЗАЮЩИХ ГОЛОСЕМЕННЫХ РАСТЕНИЙ РОДА Sequoia И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ИХ МЕТАБОЛИТОВ

Руководитель Киракосян Рима Нориковна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева" , г Москва

Конкурс №97 - Конкурс 2024 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки; 06-101 - Лесное хозяйство

Ключевые слова культура клеток, in vitro, каллусные культуры, микроклоны, секвойя, элиситация, фенольные соединения

Код ГРНТИ62.33.29

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Сохранение биоразнообразия растений и создание биоресурсных коллекций, особенно редких реликтовых растений, в настоящее время является приоритетным направлением исследований. Такие коллекции, созданные, например, на основе клеточных культур in vitro, являются источником ценных метаболитов, которые представляют интерес для различных отраслей народного хозяйства. Методы клеточной инженерии растений in vitro, в частности клональное микроразмножение позволяет сохранять ценные лекарственные и исчезающие растения. Кроме того, полученные микроклоны могут рассматриваться как потенциальные источники уникальных вторичных метаболитов - ценных биологически активных веществ, широко применяемых, например, в фармацевтической промышленности, без изъятия их из природный среды. В настоящее время известно более десятка тысяч веществ растительного происхождения обладающих фармакологической активностью, которые способны вызывать множественный терапевтический и физиологический эффект. Например, дитерпеноид, таксол, в состав которого входит фрагмент 3-(N-метиламино)-3-фенилпропаноиловая структура, являющаяся производным веществом фенольной природы синтезируется только у единственного рода, представителей реликтовых голосеменных – Taxus. На основе таксола изготавливается препарат паклетаксол, успешно применяемый в химиотерапии онкологических заболеваний. Наиболее близким к тиссу таксоном и не уступающим по своим биосинтетическим возможностям по отношению к антиоксидантам фенольной природы являются растения рода Sequoia. Sequoia sempervirens (L.) – относится к самым высоким реликтовым растениям - тысячелетним долгожителям. Растения секвойи произрастают в узкоспециализированном, сильно ограниченном ареале. Ценная древесина секвойи способна накапливать уникальные вторичные метаболиты, не имеющие синтетических аналогов. Однако данные об образовании фенольных соединений в растениях рода Sequoia единичны, а сложность физиолого-биохимических процессов, происходящих в этих реликтовых растениях, в том числе и в условиях in virto, остается еще недостаточно изученной. Культивируя клетки растений в строго контролируемых условиях in virto, но при определенных модификациях питательной среды и внешних условий выращивания, возможно, добиться целевой направленности в избирательном продуцировании этими культурами определенных веществ вторичного метаболизма. Известно, что управлять биосинтетическим потенциалом клеточных культур in vitro можно использую различные факторы физической и химической элиситации. Для клеточных культур секвойи работы такого направления будут проведены впервые. В результате исследований будет разработан протокол ускоренного получения высококачественного и высокопродуктивного, генетически однородного посадочного материала растений секвойи вечнозеленой с целью сохранения биоразнообразия, а так же получены линии-продуценты БАВ. Кроме того, впервые для клеточных культур и растений-регенерантов секвойи будут установлены различия в качественном и количественном составе неферментативных антиоксидантов на примере фенольных соединений, в том числе и флавоноидов в зависимости от различных факторов элиситации. Одними из крупнейших производителей/поставщиками сырья на основе лекарственных растений для фитофармакогнозии, парфюмерной и пищевой промышленности являются Республика Болгария (из европейских стран) и страны Юго-Восточной Азии. Однако в настоящее время глобализация, информационная революция, а также санкционная политика обострили существенные проблемы мировой экономики, что повышает актуальность импортозамещения ряда товаров и продуктов. Поэтому необходимо пересмотреть системы управления производством, логистические мероприятия и получить отечественную конкурентоспособную продукцию высокого качества. Данное направление приобретает особую актуальность не только для фитофармакогнозии, но и для пищевого, парфюмерного производства.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В рамках исследования изучены особенности локализации вторичных метаболитов в интактных растениях секвойи вечнозеленой (Sequoia sempervirens (D. Don) Endl.) и культурах in vitro , а также оценена биологическая активность экстрактов, полученных из этих тканей. Гистохимические исследования показали специфическую локализацию фенольных и терпеноидных соединений в листовой пластинке и стебле интактных растений. Они преимущественно накапливались в покровных и проводящих тканях, клетках паренхимы, стенках сосудов ксилемы, во флоэме, а также в обкладке проводящего пучка и альбуминовых клетках хвои. Полифенолы наблюдались в клеточных стенках, межклетниках и специализированных фенолзапасающих эпибластах. Реакция с ванилиновым реактивом указала на доминирование флавановых соединений, особенно в меристематических тканях. Исследования по выращиванию каллусной ткани позволили установить оптимальные условия для ее формирования. Каллусогенез начинался на 14–17-е сутки при культивировании в темноте, характеризовался средней плотностью и бело-желтым цветом. Установлено влияние типа питательной среды (MS или WPM), положения экспланта (горизонтальное или вертикальное), а также условий освещения на скорость роста, консистенцию и жизнеспособность каллуса. Вертикальное положение эксплантов в пробирках на свету способствовало более раннему образованию жизнеспособной желтоватой каллусной ткани уже на 17–20-е сутки. Однако при длительном культивировании (до 12 циклов) наблюдалось постепенное побурение каллуса, сохраняющего высокую скорость роста и наличие светлых участков в центральной части. Для получения суспензионной культуры важным фактором оказался минеральный состав питательной среды. На среде MS наблюдался более высокий ростовой индекс (I=12), тогда как на среде WPM суспензия развивалась медленнее (I=5,8), формируя крупные плотные агрегаты. При переносе культуры с WPM на среду MS рост возобновлялся, что свидетельствует о чувствительности суспензионной культуры к составу питательной среды. Гистохимический анализ каллусных и суспензионных культур показал наличие вторичных метаболитов — полифенолов и терпеноидов — в клеточных стенках, вакуолях, а также в виде гранулированных включений различной степени агрегации. В каллусной ткани, выращенной на свету, отмечено более интенсивное окрашивание на флавановые соединения, а также формирование меристематических очагов с повышенной метаболической активностью. Суспензионная культура продемонстрировала локализацию вторичных метаболитов в одиночных клетках и их агрегатах. Фунгицидная активность экстрактов, полученных из побегов интактных растений и каллусной ткани, была протестирована против Fusarium oxysporum . Ингибирование роста мицелия наблюдалось при концентрации экстракта 200 мг/л, эффект усиливался до 60% при повышении концентрации до 350 мг/л и выше. Экстракты из побегов интактных растений проявляли в 1,5 раза большее подавление роста гриба, чем экстракты из каллуса. Полного прекращения роста мицелия не наблюдалось ни в одном варианте. Цитотоксическое действие экстрактов из каллусной ткани тестировалось на клеточных линиях FetMSC (нормальные клетки), HepG2 (карцинома печени), HeLa (рак шейки матки) и А-172 (глиобластома). МТТ-тест показал, что экстракты малотоксичны для нормальных клеток, но демонстрируют значительную цитотоксичность по отношению к раковым клеткам, особенно к HeLa и А-172. Определены значения IC₅₀, которые позволили оценить эффективность действия экстрактов на опухолевые клетки. В результате работы были получены стабильные каллусные и суспензионные культуры Sequoia sempervirens, установлены зависимости их роста от условий культивирования и состава питательных сред. Впервые проведено детальное описание локализации вторичных метаболитов в различных тканях интактных растений и культурах in vitro. Показана перспективность использования данных культур как источников биологически активных веществ с фунгицидной и цитотоксической активностью. Полученные данные могут быть использованы в дальнейших исследованиях по созданию новых препаратов на основе вторичных метаболитов секвойи(Kirakosyan R.N., Kalasnikova E.A., Bolotina E.A., Saleh A., Balakina A.A., Zaytseva S.M. Localization of secondary metabolites in relict gymnosperms of the genus Sequoia in vivo and in cell cultures in vitro, and the biological activity of their extracts//Life. –2024. –Т. 14. –№ 12.– С. 1694). https://www.mdpi.com/2075-1729/14/12/1694 Зайцева С.М., Киракосян Р.Н., Цзин Л., Болотина Е.А., Калашникова Е.А. Исследование фунгицидной активности экстрактивных веществ интактных растений рода sequoia и инициированных из них каллусных культур//Естественные и технические науки. –2024.– № 12 (199).– С. 113-116. https://www.elibrary.ru/item.asp?id=80300166 )

Публикации

1. С.М. Зайцевa, Р.Н. Киракосян, Цзин Лян, Е.А. Болотина, Е.А. Калашникова ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНГИЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ ЭКСТРАКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ИНТАКТНЫХ РАСТЕНИЙ РОДА Sequoia И ИНИЦИИРОВАННЫХ ИЗ НИХ КАЛЛУСНЫХ КУЛЬТУР ЕСТЕСТВЕННЫЕ И ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ, 2024.– № 12 (199).– С. 113-116 (год публикации - 2024)

2. Kirakosyan R. N., Kalasnikova E. A., Bolotina E. A., Saleh A., Balakina A. A., Zaytseva S. M. Localization of Secondary Metabolites in Relict Gymnosperms of the Genus Sequoia In Vivo and in Cell Cultures In Vitro, and the Biological Activity of Their Extracts Life, Life. – 2024. – Т. 14. – №. 12. – С. 1694. (год публикации - 2024)
10.3390/life14121694

3. Зайцевa С.М., Киракосян Р.Н., Цзин Лян, Болотинa Е.А., СуминА.В., Калашникова Е.А. ВЛИЯНИЕ МИНЕРАЛЬНОГО СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ НА МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ РОДА Sequoia Естественные и технические науки, Естественные и технические науки.– №3 (год публикации - 2025)
10.25633/ETN.2025.03.03