Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Целью нашего проекта является исследование факторов (генетических, эпигенетических, механических и др.), контролирующих локализацию мейотических рекомбинаций. Вся классическая селекция основана на рекомбинации, которая происходит в микро- и макроспорогенезе растения приводя к новым сочетаниям аллелей, а значит признаков. Полученные знания будут использованы для интрогрессии целевых генов посредством рекомбинации и создания сортов лука репчатого с заданными свойствами. Конкретные задачи данного проекта в отчетном году стали: (1) биоинформатический анализ для создания ДНК-зондов и антител к белкам рекомбинации; (2) создание методические платформы, а именно поиск и разработка протоколов, позволяющих четко детектировать изучаемые параметры; (3) проведение пилотных экспериментов с разработанными методами; (4) закладка опытов и подготовка растительного материала для скрещивания. Изучение мейотического кроссинговера/рекомбинации требует анализа ключевых белков: MLH1, HEI10 (кроссинговеры I типа) и MUS81 (кроссинговеры II типа). Для их иммунохимической визуализации требуются высокоспецифичные антитела. Маркерами синаптонемного комплекса (СК) служат ASY1 и ZYP1. Нами были найдены последовательности этих белков у Allium cepa и Allium fistulosum на основе полноразмерных транскриптомов. С помощью AlphaFold 3 предсказаны их третичные структуры. Проверена совместимость коммерческих антител (Arabidopsis thaliana, Oryza sativa) с белками Allium. Структурное выравнивание подтвердило высокое сходство в областях эпитопов, что позволяет использовать их в иммунодетекции. Нами проведен сравнительный анализ транскриптомов 37 представителей рода Allium. В ходе исследования были обработаны данные RNA-seq, позволившие реконструировать транскриптомы и идентифицировать белок-кодирующие участки. Особое внимание уделялось ключевым мейотическим генам (MLH1, HEI10, MUS81, ASY1 и ZYP1), для которых проводили сравнительный анализ между видами. Филогенетическая реконструкция выполнена на основе множественного выравнивания аминокислотных последовательностей с последующей оценкой достоверности узлов методом бутстрапа. В качестве аутгруппы использовали ортологичные последовательности Glycine max. Дополнительно построено видовое дерево на основе полного набора белковых последовательностей. Высококачественные препараты пахитенных хромосом имеют решающее значение для изучения расположения мейотических белков. Существующие методы приготовления препаратов мейотических хромосом хорошо работают лишь для видов с небольшими хромосомами, таких как арабидопсис, томат или кукуруза. Для лука репчатого и лука-батуна, обладающих крупными геномами, существующие протоколы неэффективны: их гигантские пахитенные хромосомы остаются спутанными, что делает анализ практически невозможным. В отчетный период нами был разработан протокол приготовления пахитенных хромосом луковых, позволяющий получить хороший разброс крупных хромосом и провести на них иммунодетекцию мейотических белков. Созданный протокол позволяет проследить каждую пахитенную хромосому от теломеры-до-теломеры, а также построить кариотип и проанализировать результаты иммунодетекции на каждой индивидуальной хромосоме луковых. Нами были разработаны протоколы Immuno-ND-FISH и Immuno-FISH, позволяющие одновременно визуализировать мейотические белки и ДНК-зонды на субтеломерный и центромерный повторы луковых. Разработанные протоколы позволяют определить точную локализацию ключевых белков рекомбинации относительно центромеры и теломеры, а также идентифицировать отдельные пахитенные хромосомы с использованием хромосом-специфичных маркеров. Начаты работы по созданию цитогенетических хромосом-специфических маркеров, что позволить идентифицировать каждую пахитенную хромосому. Мы отобрали 39 (A. cepa) и 65 (A. fistulosum) хромосом-специфичных повторов, выбрав для последующего физического картирования 1-2 наиболее высокопийных кандидата на хромосому. Мы провели анализ инициации синапсиса (загрузки центрального белка СК ZYP1) относительно субтеломеры и теломеры на стадиях зиготены-пахитены у A. cepa, A. fistulosum и их диплоидного (2n = 2x = 8C + 8F) и триплоидного (2n = 3x = 16F + 8 С) F1 гибридов. Отсутствие сигналов ZYP1 в теломерных участках некоторых бивалентов A. fistulosum может указывать на роль огромного субтеломерного повтора в задержке синапсиса в этих областях. При анализе загрузки ZYP1 диплоидного гибрида обнаружены нарушения в образовании синапсиса в дистальных регионах некоторых бивалентов, а также биваленты с невыровненными теломерами. Нами были протестированы две методики визуализации паттернов метилирования. In situ Nick-трансляция проявила низкую чувствительность, поэтому был выбран метод иммунной детекции in situ сайтов метилирования антителами к 5-mC в нашей модификации. Метод будет использован для сравнительного анализа паттернов метилирования у A. cepa и A. fistulosum, видов с диаметрально противоположной локализацией рекомбинаций. Для снижения метилирования ДНК, которое может изменить распределение рекомбинации, мы использовали 5-азацитидин, аналог цитозина. Мы подобрали его оптимальную концентрацию и разработали наиболее подходящий метод обработки стрелок растений. Сравнительный анализ конфигурации бивалентов и уровня метилирования будет продолжен во время цветения растений в июне-июле 2025 года года на заложенном опыте в открытом грунте. Нами были подобраны наиболее перспективные сорта лука репчатого для скрещивания с донорами целевых генов: красный репчатый лук сорта Черный принц и Романовский, белый репчатый лук сорта Мячковский-300. Родительские растения были подвергнуты яровизации и высажены в открытом грунте.