КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер проекта 25-12-00083
НазваниеСпектроскопия комбинационного рассеяния света лиофилизированных белков
Руководитель Суровцев Николай Владимирович, Доктор физико-математических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт автоматики и электрометрии Сибирского отделения Российской академии наук , Новосибирская обл
Конкурс №104 - Конкурс 2025 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»
Область знания, основной код классификатора 02 - Физика и науки о космосе; 02-304 - Спектроскопия
Ключевые слова комбинационное рассеяния света, лиофилизированные белки, биологическая активность, хранение белков, водородно-дейтериевый обмен, инфракрасное поглощение, вторичная структура, третичная структура, быстрая релаксация
Код ГРНТИ29.31.26
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Лиофилизированная форма белка имеет важное значение в качестве реагента в биомедицинских и биохимических исследованиях, а также является важным классом препаратов для лечения многих заболеваний. Лиофилизация позволяет получать белки в твердом состоянии, обладающие долгосрочной стабильностью при хранении, удобством для транспортировки и при этом сохраняющие высокий уровень своей биологической активности при регидратации. Сохранение биологической активности и долгосрочная стабильность лиофилизированных белковых препаратов зависит от сохранения нативной структуры при лиофилизации и при хранении. Поэтому характеристика белков в лиофилизированном состоянии имеет решающее значение для разработки оптимальных протоколов лиофилизации и определения условий их хранения.
В настоящем проекте предлагается развитие экспериментальных методов с использованием спектроскопии комбинационного рассеяния света (КРС) для: характеризации вторичной и третичной структуры лиофилизированных белков, их субтерагерцового релаксационного отклика, определения влияния низкотемпературного динамического перехода на спектры КРС, определения связи спектральных характеристик с прогнозом биологической активности белка и его стабильности при данных условиях хранения (температура и влажность). На примере белков с различной вторичной структурой будет определена достоверность известных подходов к определению вторичной структуры белков по форме линии амидных мод. Будут развиты представления о механизме формирования амидной моды и о возможности использования моды NCC для характеризации вторичной структуры. Будет определено насколько информация о вторичной структуре, найденная по спектрам КРС, чувствительна к «правильному» состоянию белка и к прогнозу для хранения лиофилизированных белков с точки зрения сохранения биологической активности. Аналогичная информация будет получена для мод КРС, которые считаются чувствительными к третичной структуре белков. Будет развита спектроскопия низкочастотного (30-9000 ГГц) КРС белков, в спектре которого будет выделен вклад акустоподобных колебаний (бозонный пик) и быстрой релаксации. Будет определен потенциал использования бозонного пика для характеризации структуры белков. Будет определена чувствительность спектра быстрой релаксации к интенсивности крупномасштабных изменений структуры, к биологической активности и к прогнозу стабильности хранения. Новая методика по водород-дейтериевому обмену в белках в твердом состоянии с контролем по спектрам КРС будет развита и применена в рамках проекта. Будет оценена ее перспективность для характеризации лиофилизированных белков. Будет сделан вывод о возможностях различных методик спектроскопии КРС для описания структуры и величины релаксационного движения лиофилизированных белков, а также для оценки их биологической активности.
Ожидаемые результаты
При выполнении проекта будут развиты новые подходы на базе спектроскопии комбинационного рассеяния света (КРС), которые позволят: охарактеризовать структуру лифолизированных белков, используя моды диапазона молекулярных колебаний (амидные моды, N-C-C, S-S и другие) и моды терагерцового диапазона (акустоподобные колебания); охарактеризовать флуктуационные движения белковой молекулы, используя спектр субтерагерцовой релаксации; найти связь этих флуктуационных движений с низкотемпературным динамическим переходом в негидратированных белках; найти связь между параметрами молекулярного и низкочастотного спектров КРС и биологической активностью регидратированных белков; охарактеризовать структуру и конформационную динамику лиофилизированного белка методом водород-дейтериевого обмена с контролем по спектру КРС и найти связь с его биологической активностью при регидратации. Ожидаемые результаты являются пионерскими, соответствуют мировому уровню. По результатам исследований запланированы публикации в высокорейтинговых изданиях. Предлагаемые подходы к характеризации структуры и релаксационной активности лиофилизированных белков актуальны для оценки их биологической активности и долгосрочной стабильности при хранении и могут найти многочисленные применения в областях биологии, медицины и фармакологии.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В проекте развиваются экспериментальные методы с использованием спектроскопии комбинационного рассеяния света (КРС) для характеризации белков, их структуры и частотного отклика. Глобальной целью является определение потенциала спектроскопии КРС для задач описания особенностей лиофилизированных белков, описание их структуры и поиск спектральных характеристик, позволяющих делать прогноз биологической активности лиофилизированного белка и его стабильности при данных условиях хранения (температура и влажность). В отчетном году был изучен потенциал спектроскопии КРС для описания вторичной и третичной структуры белка, используя в качестве модели четыре белка, различающихся по составу вторичных структур: альфа-спиралей, бета-структур и неупорядоченных структур. Белки были исследованы в лиофилизированном состоянии, в форме раствора и в сухом денатурированном состоянии. Показано, что, хотя качественно спектральная форма амидной полосы в спектре КРС отражает преобладающую вторичную структуру белка, существующие подходы к ее описанию не могут дать достоверного результата для количественной оценки доли различных вторичных структур. Продемонстрировано, что совместное использование спектров ИК поглощения и КРС имеет хороший потенциал для решения этой проблемы, так как полоса бета–структур хорошо выделяется в ИК спектре, а полоса альфа-спиралей – в спектре КРС. Также показано, что упорядоченные вторичные структуры имеют более высокий коэффициент поляризации и их вклад может быть выделен в поляризованном спектре КРС. Продемонстрирована перспективность использования скелетных колебаний NCC для идентификации упорядоченных вторичных структур. Сделан вывод о хорошем соответствии вторичных структур белков в растворе и в лиофилизированном состоянии.
Исследование пиков колебательных мод S-S связей и пиков тирозина в спектрах КРС белков показало их чувствительность к изменениям третичной структуры. Однако нами было показано, что обратное утверждение в общем случае не верно – денатурация альбумина при выбранной нами температуре меняет вторичную структуру, а пики колебаний S-S и тирозина остаются неизменными.
Исследованы поляризованные спектры КРС и спектры ИК поглощения от человечьего и бычьего коллагена I и III типа. Детальная интерпретация наблюдаемых колебательных пиков дана с помощью численного моделирования. Обнаружено, что наиболее ярким спектральным маркером для различения коллагенов I и III типов по спектрам КРС является соотношение интенсивностей пика фенилаланина при 1004 см-1 и пика при 816 см-1.
Развита спектроскопия низкочастотного КРС белков, и получены экспериментальные спектры исследуемых белков вплоть до 1 см-1 (30 ГГц) от возбуждающей лазерной линии. Наблюдаемые спектры имеют два вклада: акустоподобный колебательный спектр (бозонный пик) аналогичный случаю органических полимеров и вклад быстрой релаксации, доминирующий на частотах ниже 10 см-1. Получено, что низкочастотный акустоподобный спектр слабо зависит от состава вторичных структур белка и от гидратации белка. Найдено, что в случае лиофилизированных и денатурированных сухих белков интенсивность спектра быстрой релаксации примерно одинакова и описывается предельно широким распределением времен релаксации. Быстрая релаксация белков в растворе примерно на порядок выше по интенсивности, и ее спектральное поведение соответствует поведению вязкой жидкости. Сделано заключение, что быстрая релаксация не связана однозначно с вторичной и третичной внутренней структурой белка, а зависит от степеней свободы, которые высвобождаются при растворении. Интенсивность быстрой релаксации может характеризовать доступные для релаксации степени свободы, которые должны быть связаны со скоростью перехода белка из одного структурного состояния в другое и, возможно, коррелировать с сохранностью биоактивности лиофилизируемого белка.
Создана установка, которая позволяет изучать водород-дейтериевый обмен в белках через пары воды контролируемой влажности по спектрам КРС. Проведены тестовые измерения обмена в случае лиофилизированного лизоцима, показана работоспособность установки, и сделано заключение о ее хорошем потенциале для метода водород-дейтериевого обмена.