КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер проекта 25-15-00043
НазваниеИсследование нейропротекторных и нейротрофных свойств дофаминового нейротрофического фактора мозга (CDNF) в норме и при протеинопатиях
Руководитель Науменко Владимир Сергеевич, Доктор биологических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук" , Новосибирская обл
Конкурс №104 - Конкурс 2025 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»
Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-106 - Нейробиология
Ключевые слова Дофаминовый нейротрофический фактор мозга (CDNF), нейропластичность, поведение, стресс ЭПР, модель накопления alpha-синуклеина, мыши линии Prnp-SNCA*A53T, агрегация Tau-белка, аденоассоциированные вирусные конструкты
Код ГРНТИ34.15.43
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Дофаминовый нейротрофический фактор мозга (CDNF) – уникальный нейротрофический фактор (НТФ), поскольку не имеет специфических рецепторов на клеточной мембране и существует преимущественно в мембране ЭПР, но может покидать её в условиях сильного клеточного стресса [1,2]. Было неоднократно продемонстрировано, что введение рекомбинантного белка CDNF, или аденоассоциированного (AAV) конструкта, обеспечивающего сверхэкспрессию CDNF, защищало и восстанавливало ДА нейроны в фармакологических моделях болезни Паркинсона (БП) [3]. Первая фаза клинических испытаний рекомбинантного белка CDNF показала безопасность интрастриатальных инъекций CDNF у пациентов с БП, однако эффект на моторные функции и обмен ДА у испытуемых был скромным [4]. Неудача клинических испытаний диктует необходимость дальнейшего изучения биологии CDNF и поиск новых подходов для терапевтического применения данного НТФ. Одним из таких подходов могло бы стать создание модифицированной секретируемой формы CDNF, которая, будучи трансдуцирована в нейроны, могла бы секретироваться во внеклеточное пространство на постоянной основе, что позволило бы увеличить биодоступность НТФ и устранить необходимость регулярных инфузий рекомбинантного белка.
Недавние работы на мышах и рыбах Danio rerio c полным нокаутом CDNF показали, что этот НТФ участвует в созревании разнообразных типов нейронов, следовательно, его эффекты не ограничиваются исключительно ДА системой [5,6]. Уникальная структура CDNF подразумевает его полифункциональность. N-конец содержит сигнальную последовательность, необходимую для трансляции в ЭПР, а также сапозиноподобный домен, способный контактировать с мембранами и липидами [2,7]. Через N-конец CDNF взаимодействует с олигомерами alpha-синуклеина, предотвращая их агрегацию [8]. C-концевой мотив CXXC ассоциируют с цитопротекторным и антиапоптотическим действием [9,10], в то время как наличие N-терминального домена предполагает нейротрофные функции [7]. Вместе с тем, в отличие от цитопротекторных свойств, нейротрофные функции CDNF изучены слабо.
В исследованиях CDNF существует заметное противоречие. Так, во многих экспериментах на животных и в клинических испытаниях использовался рекомбинантный белок CDNF, который является, по сути, секретированной формой, в то время как наиболее выраженными цитопротекторными свойствами обладает CDNF, локализованный в ЭПР [11]. В то же время нейротрофный потенциал, вероятно, реализуется в основном секретируемой формой CDNF. Разрешению данного противоречия помогло бы создание модифицированного CDNF, который смог бы переходить в секретируемую форму, не теряя при этом способности к иммобилизации в ЭПР.
Целью данного проекта является изучение нейротрофных и нейропротекторных функций CDNF как в норме, так и при нейропатологиях, ассоциированных с нарушением белкового гомеостаза. Мы планируем создать секретируемую форму CDNF способную к иммобилизации в ЭПР и, доставляя её в нейроны с помощью AAV-конструктов, проанализировать нейропротекторный и нейротрофный потенциал in vitro, а также in vivo в фармакологической модели БП и экспериментальных моделях накопления alpha-синуклеина и Tau-белка. Кроме того, нами планируется сравнение эффектов сверхэкспрессии в гиппокампе секретируемой и несекретируемой форм CDNF на поведение и нейропластические процессы здоровых животных.
Оснований сомневаться в достижимости результатов нет, поскольку в лаборатории нейрогеномики поведения, на базе которой будет выполняться проект, налажены и используются методы регуляции экспрессии генов в структурах мозга животных in vivo при помощи AAV-конструктов. Доступна оригинальная модель накопления человеческого alpha-синуклеина – мыши линии Prnp-SNCA*A53T и набор современных методов исследования поведения, экспрессии генов и иммуноцитохимии. Основные исполнители проекта – специалисты в области исследования генетических и молекулярных основ регуляции поведения, а участники проекта – молодые научные сотрудники с большим опытом экспериментальной работы.
Ожидаемые результаты
В ходе реализации проекта будет сконструирован мутантный CDNF путём замены его сигнального пептида на сигнальный пептид куриного лизоцима [12], и встроен под контроль синапсинового промотора в AAV-вектор, что обеспечит целевую доставку конструкта в нейроны. Будет оценена эффективность секреции получившегося белка во внеклеточную среду. Затем цитопротекторные свойства секретируемого CDNF (mutCDNF) будут оценены на культуре перевиваемых клеток, обработанных туникамицином, вызывающим стресс ЭПР. Аналогичные тесты будут проведены на первичной культуре нейронов гиппокампа мыши. Кроме того, на первичной культуре нейронов будет проведено сравнение эффектов секретируемой и несекретируемой форм CDNF на морфологию и рост дендритов.
Для того чтобы провести оценку нейротрофных свойств mutCDNF in vivo, мы индуцируем сверхэкспрессию секретируемой или несекретируемой форм CDNF в гиппокампе мышей C57Bl/6J и сравним эффекты, оказываемые на двигательную активность, тревожное, исследовательское и социальное поведение, а также пространственное обучение и память. Также мы проанализируем экспрессию ключевых эффекторов процесса долговременной потенциации (CREB, c-Fos, BDNF) и генов-регуляторов стресса ЭПР.
Цитопротекторные свойства mutCDNF in vivo будут оценены в модели БП, индуцированной унилатеральной инъекцией 6-OHDA в медиальный пучок переднего мозга мышей C57Bl/6J. При инъекции AAV-mutCDNF в чёрную субстанцию, поражённую действием токсина, будет изучен его эффект на моторные функции и ритмы сна животных и плотность ТН-позитивных нейронов в чёрной субстанции. Также будет оценена экспрессия генов-регуляторов стресса ЭПР.
На мышах линии Prnp-SNCA*A53T мы оценим способность секретируемого CDNF к разрушению патологических белковых агрегатов, сделав инъекции AAV-mutCDNF в чёрную субстанцию животных в момент начала накопления alpha-синуклеина (3 месяца), с последующей оценкой числа телец Леви в возрасте активной манифестации (5 месяцев).
Оценку способности mutCDNF противодействовать агрегации Tau-белка мы проведём в экспериментальной модели болезни Альцгеймера. Для этого в нейроны гиппокампа мышей C57Bl/6J будет осуществлена ко-трансдукция AAV-mutCDNF и AAV-конструкта, кодирующего мутантную форму Tau-белка человека [R406W], склонного к агрегации. В последующем будет проведена оценка степени накопления и фосфорилирования Tau и эффектов на контекстуальную память животных в парадигме условно-рефлекторного пассивного избегания.
Результаты, полученные в ходе реализации проекта, позволят определить: 1) эффективность секреции mutCDNF во внеклеточное пространство; 2) сохраняет ли mutCDNF функциональную активность и цитопротекторные свойства и/или превосходит ли таковыми несекретируемую форму CDNF; 3) способна ли mutCDNF препятствовать патологической агрегации белков; 4) оказывает ли mutCDNF эффекты на нейрональную пластичность в здоровом мозге, может ли модулировать поведение и каковы сходства и различия с несекретируемой формой CDNF.
Запланированное в рамках данного проекта всестороннее исследование нейропротекторных и нейротрофных свойств CDNF решает не только фундаментальные задачи, но и имеет несомненную трансляционную значимость. Для таких распространённых нейродегенеративных заболеваний как болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера до сих пор не имеется эффективных средств лечения. Результаты, полученные при реализации проекта, могут помочь создать оригинальное средство терапии нейропатологий, ассоциированных с накоплением токсичных белковых агрегатов.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Дофаминовый нейротрофический фактор мозга (CDNF) – уникальный нейротрофический фактор (НТФ), поскольку не имеет специфических рецепторов на клеточной мембране и существует преимущественно в мембране ЭПР, но может покидать её в условиях сильного клеточного стресса. Введение рекомбинантного белка CDNF, или аденоассоциированного (AAV) конструкта, обеспечивающего сверхэкспрессию CDNF, защищало и восстанавливало дофаминовые (ДА) нейроны в фармакологических моделях болезни Паркинсона (БП). Однако, результаты клинических испытаний показали достаточно скромные эффекты CDNF на моторные функции и обмен ДА. Неудача клинических испытаний диктует необходимость дальнейшего изучения биологии CDNF и поиск новых подходов для терапевтического применения данного НТФ. Одним из таких подходов могло стало создание модифицированной секретируемой формы CDNF, которая, будучи трансдуцирована в нейроны, могла бы секретироваться во внеклеточное пространство на постоянной основе, что позволило бы увеличить биодоступность НТФ и устранить необходимость регулярных инфузий рекомбинантного белка. В рамках данного проекта была создана плазмида pcDNA3.1(+)-mutCDNF, кодирующая CDNF, способный конститутивно секретироваться клеткой во внеклеточную среду. Для этого исходную последовательность участка гена, кодирующего сигнальный пептид CDNF, заместили на последовательность сигнального пептида куриного лизоцима. Доказано, что полученный модифицированный белок действительно секретируется во внеклеточную среду. В то же время часть его все же остается локализована внутри клетки. За счет этого мутантный CDNF не утратил своих цитопротекторных свойств. В эксперименте с туникамицином (индуктором стресса ЭПР) показаны цитопротекторные эффекты как немодифицированного, так и мутантного CDNF, отражающиеся в сопротивляемости клеток индукции стресса ЭПР. Показано, что созданный нами секретируемый CDNF усиливает рост нейритов в культуре клеток нейробластомы мыши N1E-115, в отличие от немодифицированного белка. Обнаружено, что секретируемый CDNF оказывает существенное влияние на ключевые гены, вовлеченные в регуляцию каскада UPR: mutCDNF повлиял на экспрессию гена Grp78. Под влиянием mutCDNF снизилась экспрессия Atf4, однако при апостериорном сравнении было выявлено, что разница имеет место только при сравнении с группой CDNF. На экспрессию Ire1α оказывал влияние как секретируемый, так и немодифицированный CDNF. Также изменилась экспрессия несплайсированного Xbp1 (uXbp1) за счет снижения в группе mutCDNF как относительно группы pcDNA, так и относительно группы CDNF, что, однако, не отразилось на уровне сплайсированного Xbp1 (sXbp1) и на отношении sXbp1/uXbp1. При этом ни CDNF, ни mutCDNF не повлиял на уровни белков, кодируемых генами, вовлеченными в регуляцию процессов нейрональной пластичности (Akt, Cdk-5, Creb, C-fos, Erk, Pkc).
Создан и верифицирован аденоассоциированный (AAV) вирусный конструкт, несущий плазмиду pAAV-Syn-mutСDNF-EGFP, кодирующую CDNF, способный конститутивно секретироваться клеткой во внеклеточную среду. Подтверждено, что созданные плазмиды усиливают экспрессию СDNF как на уровне мРНК, так и на уровне белка, на первичной культуре нейронов фронтальной коры мыши. Однако, ни CDNF, ни mutCDNF не повлиял на экспрессию исследованных нами генов UPR и нейропластичности.
Обнаружено, что немодифицированный CDNF вызывает усиление Са2+ активности нейронов во фронтальной коре мышей C57Bl/6 in vivo. При этом, введенная нами модификация сигнального пептида CDNF привела к исчезновению эффектов CDNF на Са2+-зависимые внутриклеточные сигнальные каскады.
Выявлены поведенческие отличия мышей линии Prnp-SNCA*A53T, экспрессирующих человеческий α-синуклеин с мутацией (A53T), связанной с болезнью Паркинсона, от их «здоровых» однопометников. Показано, что наличие α-синуклеина человека с мутацией A53T оказало влияние на циклы сон/бодрствование животных. Мыши Prnp-SNCA*A53T демонстрировали снижение количества эпизодов сна в светлое время суток. Выявленные нарушения сна представляют значительный интерес, так как соотносятся с нарушениями ритмов сна у пациентов с болезнью Паркинсона и могут рассматриваться в качестве раннего проявления патологического состояния у мышей линии Prnp-SNCA*A53T. Наличие α-синуклеина человека с мутацией A53T также повлияло на некоторые моторные навыки животных. Начиная с четвертого месяца животные Prnp-SNCA*A53T проходили большее расстояние в домашней клетке, чем животные дикого типа. Такая гиперактивность не повлияла на латентное время падения в тесте «Rotarod». Генотип не оказал эффекта на прохождение этого теста, а с возрастом даже отмечается улучшение способности животных справляться с задачей. Подобные результаты неоднократно отмечались в других исследования, что и ставит вопрос о поиске иных поведенческих маркёров патологического процесса у мышей линии A53T. В ходе работ в рамках данного проекта мы выявили увеличение силы хвата у мышей Prnp-SNCA*A53T. Начиная с четвертого месяца, животные из группы A53T демонстрировали большую силу хвата.