КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

---

Номер проекта 25-15-00548

НазваниеХемогенетический инструмент для регуляции Н2S при нейропатологиях

Руководитель Билан Дмитрий Сергеевич, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук , г Москва

Конкурс №104 - Конкурс 2025 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-106 - Нейробиология

Ключевые слова H2S, хемогенетика, редокс биология, ишемический инсульт, нейропатологии, нейромышечная передача, Danio rerio

Код ГРНТИ34.15.43

---

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

---

Аннотация
H2S является токсичным газом, который при растворении в воде демонстрирует свойства слабые двухосновной кислоты. При этом во многих биологических реакциях H2S выступает в роли нуклеофила, демонстрируя свойства хорошего двух-электронного восстановителя. Как и с другими редокс-активными низкомолекулярными компонентами, вскоре выяснилось, что H2S активно синтезируется многими клетками. В различных тканях синтез H2S может отличаться по ферментам. Биологическая функция H2S обусловлена его хорошей способностью проникать через мембраны и широким спектром мишеней для взаимодействия, включая белки, нуклеиновые кислоты, многие окислители среди активных форм кислорода, азота, галогенов. По некоторым оценкам физиологическая концентрация H2S в периферической крови колеблется от 30 до 100 мкмоль/л, а уровень H2S в мозге млекопитающих составляет 50-160 мкмоль/л. Внутриклеточная концентрация H2S, вероятно, в норме не превышает 10-20 нМ. К настоящему моменту накоплено достаточно данных, позволивших уверенно отнести H2S к важной регуляторной молекуле. Ранее неоднократно отмечалось, что нарушение внутриклеточной динамики H2S приводит к развитию патологических состояний. Причем при некоторых состояниях (например, при некоторых онкологических, воспалительных реакциях, начальных стадиях диабета) отмечен повышенный уровень H2S, а при других отмечен пониженный (например, при ишемическом повреждении тканей, при атеросклерозе, сердечной недостаточности, ряде нейродегенеративных заболеваниях). Таким образом, исходя из этой информации, для терапии одних заболеваний усилия следует направить на развитие подходов ингибирования синтеза H2S, а для других, наоборот, на поддержание физиологически необходимых уровней H2S, компенсируя недостаточный уровень синтеза H2S и/или активные механизмы его нейтрализации. Главная трудность применения молекул-доноров H2S заключается в ограниченных возможностях направленной доставки подобных соединений в интересующие типы клеток и тканей. В настоящем Проекте мы предлагаем принципиально новый подход образования H2S не только в интересующих типах клеток, но и их компартментах. Мы разработаем первый в мире хемогенетический инструмент для контролируемой генерации H2S на основе фермента из класса D-цистеин десульфгидраз (DCYD), свойственного некоторым бактериям и растениям. В качестве субстрата DCYD использует D-цистеин с образованием пирувата и H2S. Будучи белковой молекулой по своей природе, ген такого инструмента легко можно экспрессировать в любых типах клеток и тканей модельных организмов. Мы детально охарактеризуем ключевые биохимические свойства полученного нами нового хемогенетического инструмента. Мы будем использовать популярный в мире объект рыбу Danio rerio для моделирования травмы спинного мозга и периферических нервов и определим с помощью разработанного инструмента, как генерация H2S в нейронах и клетках мышц влияет на развитие патологии и последующую регенерацию. В модели ишемического инсульта у крыс, вызванного окклюзией средней мозговой артерии, мы по отдельности выясним, как генерация H2S в цитозоле и матриксе митохондрий нейронов и астроцитов влияет на динамику ишемического повреждения в острой фазе патологии и на более поздних стадиях. Для H2S показаны свойства антиоксидантного и противовоспалительного агента, а также индуктора ангиогенеза и модулятора ионных токов, мы ожидаем наблюдать комплексное позитивное воздействие локальной и контролируемой генерации H2S на восстановление нейромышечной передачи, а также ишемического повреждения. Полученные в рамках настоящего проекта результаты станут важным дополнением к пониманию молекулярных механизмов различных нервных и нейромышечных заболеваний, потенциально откроют путь к новым подходам в их терапии. Созданный хемогенетический инструмент в дальнейшем позволит в различных in vivo моделях оценивать терапевтический потенциал подходов, направленных на повышение концентраций H2S в определенных типах клеток тканей.

Ожидаемые результаты
В ходе реализации настоящего Проекта будет впервые разработан хемогенетический инструмент для изучения эффекта H2S на развитие таких нейропатологий, как ишемический инсульт головного мозга, травмы спинного мозга и периферических нервов, а также будет исследована роль H2S в динамике восстановления. Для этого: 1. Будет проведен поиск и тестирование белка-кандидата на роль хемогенетического генератора H2S. К настоящему моменту принятые для использования in vivo подходы к доставке H2S в ткани организма не отвечают ряду требований. Главный недостаток существующих синтетических доноров заключается в отсутствии возможности локальной генерации H2S в интересующих тканях, обладая лишь системным эффектом повышения концентрации H2S в крови и плазме, что может оказывать токсический эффект на другие типы клеток. Наиболее перспективными белками на роль хемогенетического генератора H2S являются представители класса D-цистеин десульфгидраз (DCYD), свойственные растениям и бактериям [1–5]. DCYD демонстрируют хиральную селективность по отношению к субстрату и используют в реакции D-цистеин с образованием пирувата и H2S. Мы отберем наиболее перспективный фермент среди известных гомологов и создадим на его основе молекулярный инструмент генерации H2S, детально охарактеризуем его свойства, в том числе в эукариотических клетках с использованием синтетических селективных красителей. Мы также исследуем субстратную специфичность хемогенетического инструмента и подберем оптимальный для применения in vivo субстрат, в роли которого может выступать любая серосодержащая D-аминокислота. 2. Будет оценено влияние разных концентраций H2S на работу дыхательной цепи митохондрий. Известно, что H2S способен оказывать разный эффект на работу митохондрий. При низких концентрациях H2S выступает дополнительным донором восстановительных эквивалентов и даже может напрямую восстанавливать цитохром с [6]. Однако высокие концентрации оказывают противоположный эффект, H2S связывается гемовыми центрами комплексов дыхательной цепи, оказывая ингибирующий эффект и нарушая транспорт электронов [7]. На первичной культуре нейронов, полученной из грызунов, мы оценим продуктивность генерации H2S в зависимости от концентрации субстрата, добавляемого в клеточную среду. С помощью подходов Рамановской микроспектроскопии оценим эффект разных концентраций эндогенного H2S на редокс-состояние цитохромов, что позволит определить загрузку электрон-транспортной цепи. Такая работа по прямой оценки влияния H2S на дыхательную цепь митохондрий будет проведена впервые. 3. Будет оценен эффект H2S на пресинаптические и постсинаптические процессы в нервно-мышечном синапсе в моделях травм спинного мозга и периферических нервов на модельном объекте рыбе Danio rerio. Основными симптомами травм спинного мозга являются частичная или полная потеря сенсорных и/или двигательных функций (включая функции дыхательных мышц), спастичность скелетной мускулатуры - все эти состояния являются индикаторами повреждения нейромышечной связи. Из литературных данных известна H2S-опосредованная модуляция калиевых, кальциевых и натриевых токов в возбудимых клетках, которая затрагивает взаимодействия с множеством ионных каналов, в том числе ионотропных рецепторов. Нами будут созданы трансгенные линии рыб D.rerio с экспрессией гена полученного хемогенетического генератора H2S под нейрональным промотором elavl3 и промотором скелетной мускулатуры mylz2. В качестве репортера экспрессии генетических конструкций в нужных типах клеток будем использовать красный флуоресцентный белок mRuby или зеленый GFP. Малькам полученных трансгенных линий будут проведены операции по механическому травмированию спинного мозга и периферических нервов с помощью повреждения лазером [8] и механическим разрывом тканей при помощи иглы [9]. Эффект генерации H2S на восстановление нервно-мышечного синапса будет исследован как по отдельности в пре- и постсинаптических процессах, так и в тандеме. Для этого мы проведем операцию по повреждению спинного мозга рыбам трех линий: с экспрессией созданного хемогенетического инструмента исключительно в нейронах, с его экспрессией исключительно в скелетной мускулатуре и малькам с экспрессией данного инструмента в обоих типах клеток. Мы сравним, как продукция H2S будет влиять на темпы регенерации спинного мозга и восстановление двигательной активности рыб, сравнивая с контрольной группой тех же трансгенных животных с отсутствием субстрата для запуска ферментом продукции H2S. 4. В случае выявления позитивной динамики регенеративной и двигательной функций на модели травмы спинного мозга и периферических нервов у рыб мы исследуем вклад противовоспалительной активности H2S в терапевтическую динамику. Для этого мы используем созданных ранее в нашей лаборатории трансгенных D. rerio с нейтрофилами, экспрессирующими биосенсор для регистрации динамики галогенирующего стресса Hypocrates [10] для оценки их редокс-статуса, а также миграционную активность в область повреждения. 5. Будет исследован эффект генерации H2S на динамику ишемического повреждения тканей мозга в модели окклюзии средней мозговой артерии у крыс в острой фазе, а также на поздних стадиях патогенеза и последующего восстановления. Мы оценим эффект при локализации хемогенетического инструмента отдельно в нейронах и астроцитах. Мы также сравним эффект при локализации разработанного молекулярного инструмента в цитозоле и матриксе митохондрий указанных типов клеток. Доставка гена инструмента с промоторами для экспрессии в нейронах (hSyn1) или астроцитах (GFAP) будет осуществляться с помощью аденоассоциированных вирусов. Предварительно мы исследуем, как экспрессия генератора H2S будет влиять на редокс-параметры тканей мозга, оценим морфологию клеток и поведенческие особенности животных в зависимости от дозы субстрата. Затем опытной группе животных в острой фазе инсульта будет инъецирован D-цистеин в подобранной дозе или другие найденные эффективные субстраты, на последующих этапах субстрат будет добавляться в питьевую воду. Контрольным животным субстрат для генерации H2S добавляться не будет. Мы сравним, как продукция H2S в разных типах клеток и их компартментах влияет на объем ишемического инсульта у крыс и динамику последующего восстановления (объем будет оценен по данным МРТ и окраске полученных срезов специальными красителями). При положительном эффекте генерации Н2S на динамику ишемического повреждения крысам будут поставлены основные поведенческие тесты, позволяющие выявить изменения суточной активности, моторику, пространственную память. Мы разработаем первый хемогенетический генератор H2S, который детально охарактеризуем в клеточных культурах и в моделях in vivo в тканях рыб D.rerio и крыс. Полученный молекулярный инструмент будет способствовать дальнейшим исследованиям роли Н2S во множестве медико-биологических направлений. Полученные молекулярные инструменты, коллекция вирусных векторов для их доставки в разные типы клеток, трансгенные линии рыб могут быть применены в других исследованиях как фундаментальных, так и прикладных, в том числе в качестве основы для платформ скрининга лекарственных препаратов, направленных на воздействие метаболизма сигнальной молекулы Н2S. Данные о роли Н2S в развитии выбранных нами моделей нейропатологий будут получены впервые в мире. Список литературы: 1. Zhao Y.-Q., Hu K.-D., Yao G.-F., Wang S.-Y., Peng X.-J., Zhang H. A D-cysteine desulfhydrase, SlDCD2, participates in tomato fruit ripening by modulating ROS homoeostasis and ethylene biosynthesis // Horticulture Research. — 2023. — Т. 10. — № 3. — C. uhad014. 2. Yamasawa R., Saito H., Yashima Y., Ito H., Hamada S. Identification, characterization, and application of a d-cysteine desulfhydrase from rice seed (Oryza sativa L.) // Protein Expression and Purification. — 2023. — Т. 211. — C. 106341. 3. Soutourina J., Blanquet S., Plateau P. Role of D-cysteine desulfhydrase in the adaptation of Escherichia coli to D-cysteine // The Journal of Biological Chemistry. — 2001. — Т. 276. — № 44. — C. 40864-40872. 4. Ekimova G.A., Fedorov D.N., Tani A., Doronina N.V., Trotsenko Y.A. Distribution of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase and D-cysteine desulfhydrase genes among type species of the genus Methylobacterium // Antonie Van Leeuwenhoek. — 2018. — Т. 111. — № 10. — C. 1723-1734. 5. Bharath S.R., Bisht S., Harijan R.K., Savithri H.S., Murthy M.R.N. Structural and mutational studies on substrate specificity and catalysis of Salmonella typhimurium D-cysteine desulfhydrase // PloS One. — 2012. — Т. 7. — № 5. — C. e36267. 6. Collman J.P., Ghosh S., Dey A., Decréau R.A. Using a functional enzyme model to understand the chemistry behind hydrogen sulfide induced hibernation // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 2009. — Т. 106. — № 52. — C. 22090-22095. 7. Nicholls P. Inhibition of cytochrome c oxidase by sulphide // Biochemical Society Transactions. — 1975. — Т. 3. — № 2. — C. 316-319. 8. Dehnisch Ellström I., Spulber S., Hultin S., Norlin N., Ceccatelli S., Hultling C., Uhlén P. Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses // Journal of Neuroscience Methods. — 2019. — Т. 311. — C. 259-266. 9. Hossainian D., Shao E., Jiao B., Ilin V.A., Parris R.S., Zhou Y., Bai Q., Burton E.A. Quantification of functional recovery in a larval zebrafish model of spinal cord injury // Journal of Neuroscience Research. — 2022. — Т. 100. — № 11. — C. 2044-2054. 10. Kostyuk A.I., Tossounian M.-A., Panova A.S., Thauvin M., Raevskii R.I., Ezeriņa D., Wahni K., Van Molle I., Sergeeva A.D., Vertommen D., Gorokhovatsky A.Y., Baranov M.S., Vriz S., Messens J., Bilan D.S., Belousov V.V. Hypocrates is a genetically encoded fluorescent biosensor for (pseudo)hypohalous acids and their derivatives // Nature Communications. — 2022. — Т. 13. — № 1. — C. 171.

---

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

---