КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер проекта 25-23-00303
НазваниеНовые гетероциклические производные нейростероидов как потенциальные модуляторы ГАМКА-рецепторов: синтез, биологическая активность и моделирование взаимодействия с молекулярной мишенью.
Руководитель Россохин Алексей Владимирович, Кандидат физико-математических наук
Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Российский центр неврологии и нейронаук" , г Москва
Конкурс №102 - Конкурс 2025 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами»
Область знания, основной код классификатора 03 - Химия и науки о материалах; 03-103 - Синтез, строение и свойства природных и физиологически активных веществ; медицинская химия и прогнозирование различных видов биоактивности
Ключевые слова нейроактивные стероиды, гетероциклические соединения, синтетические аналоги аллопрегнанолона, имидазо[1,2-a]пиридиновые препараты, рецепторы гамма-аминомасляной кислоты А-типа, изолированные нейроны, метод локальной фиксации потенциала, молекулярное моделирование, Монте Карло минимизация энергии, молекулярная динамика
Код ГРНТИ31.21.00
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Ожидаемые результаты
В рамках выполнения проекта ожидаются следующие научные результаты:
• впервые методами молекулярного моделирования будет проведен анализ лиганд-рецепторных взаимодействий производных аллопрегнанолона, модифицированного имидазо[1,2a]пиридиновым фрагментом по 21-му положению стероидного каркаса через линкер варьируемой длины, с нейростероидным и бензодиазепиновым сайтами связывания модели открытого ГАМКАР подтипа α1β2γ2. Будут определены основные структурные детерминаты связывания в нейростероидном и бензодиазепиновом сайтах и построены структурные модели связывания. С применением метода молекулярной динамики будет определена устойчивость связывания гибридов с ГАМКАР.
• впервые методами молекулярного моделирования будет проведен анализ лиганд рецепторных взаимодействий нейростероидов модифицированных имидазо[1,2a]пиридиновым фрагментом по 17-му положению в отношении нейростероидного и бензодиазепинового сайтов связывания модели открытого ГАМКАР подтипа α1β2γ2. Будут определены основные структурные детерминаты связывания в нейростероидном и бензодиазепиновом сайтах и построены структурные модели связывания. С применением метода молекулярной динамики будет определена устойчивость связывания гибридов с ГАМКАР.
• будет реализован направленный многостадийный синтез серии (более 5 соединений) ранее не описанных в мировой литературе производных аллопрегнанолона модифицированных имидазо[1,2a]пиридиновым фрагментом по 21-му положению через линкер варьируемой длины. В том числе, будет проведена наработка исходного аллопрегнаннолона из ацетата прегнанолона и химическая модификация различными функциональными группами целевых структур с целью повышения активности в отношении ГАМКА-рецептора. Будут разработаны методы очистки целевых соединений с применением колоночной хроматографии.
• будет реализован направленный многостадийный синтез нейростероидов модифицированных имидазо[1,2a]пиридиновым фрагментом по 17-му положению из 21-галоген-20-кетозамещенных стероидов и 2-аминопиридинов. Будут разработаны удобные методы синтеза и выделения продуктов; установлены границы применимости метода и наработана представительная серия продуктов (не менее 10 соединений), содержащих различные заместители в имидазо[1,2a]пиридиновом остатке. С целью установления влияния гетероциклического фрагмента на профиль активности целевых соединений будут получены структурные S-аналоги имидазо[1,2-a]пиридиновых производных, а именно С-17 имидазо[2,1-b]тиазольные, имидазо[2,1-b]тиадиазольные и имидазо[2,1-b]бензотиазольные производные, для которых будет проведена независимая оценка активности.
• впервые в экспериментах in vitro с помощью пэтч-кламп регистрации ГАМК-активируемых токов в изолированных клетках Пуркинье будут выявлены потенцирующие свойства вновь синтезированных соединений. Будут выявлены характеристики их потенцирующего действия (ЕС50, Еmax), которые будут сопоставлены с соответствующими характеристиками аллопрегнанолона и золпидема.
• впервые будет проведена оценка in vivo поведенческих эффектов соединений-лидеров, способных потенцировать токи на клетках Пуркинье а модельных животных Zebrafish. Предполагается сопоставление сразу с двумя препаратами сравнения - аллопрегнанолоном и золпидемом.
• впервые будет проведено сопоставление профилей активности имидазо[1,2-а]пиридиновых производных нейростероидов различного строения с целью установления взаимосвязи структура-активность и выявления соединений-лидеров перспективных для дальнейших углубленных медико-биологических исследований.
• По результатам исследований предполагается публикация 3-х статей в высокорейтинговых зарубежных журналах. Результаты выполнения проекта войдут в одну дипломную работу. Запланированы выступления на российских и международных конференциях (не менее 2-х за весь срок выполнения проекта).
Полученные результаты будут соответствовать мировому уровню исследований и могут иметь несколько направлений использования:
1. Расширение фундаментальных представлений о взаимосвязи структура-активность по отношению к ГАМКАР для нейростероидов и гетероциклических соединений, установление их молекулярного механизма взаимодействия с рецепторами. Испытания биологической активности целевых соединений, и визуализация их лиганд-рецепторных взаимодействий могут помочь в изучении механизма взаимодействия ПАМ с ГАМКАР in vitro и установлении влияния структуры модулятора на его активность.
2. Целевые соединения могут иметь и практическую ценность. Новые гетероциклические производные нейростероидов могут стать новыми высокоэффективными аллостерическими модуляторами ГАМКАР, в которых фармакофорные фрагменты не конкурируют за сайт связывания мишени. Целевые соединения могут оказаться перспективными для разработки неседативных быстродействующих лекарственных средств, не вызывающих привыкания и характеризующихся возможностью использования в профилактических целях. Этому будет способствовать массив междисциплинарные экспериментальные данные in silico-in vitro-in vivo по сопоставлению структура-активность, накопленные при выполнении проекта.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Рецепторы γ-аминомасляной кислоты типа А (ГАМКАР) опосредуют процессы быстрого торможения в ЦНС. ГАМКАР напрямую или опосредованно участвуют в патогенезе различных социально значимых заболеваний: депрессии, шизофрении, биполярных расстройств, бессонницы, эпилепсии и других. Данный проект направлен на решение фундаментальной научной проблемы - разработку новых классов позитивных аллостерических модуляторов (ПАМ) ГАМКАР, которые могут найти применение в клинической практике для лечения этих заболеваний.
Большое внимание исследователей привлечено к возможности использования в качестве лекарственных препаратов нейростероидов - эндогенных молекул, которые синтезируются в ЦНС. Нейростероид аллопрегнанолон (АЛП) относится к ПАМ ГАМКАР и потенцирует эти рецепторы. Благодаря крио-электронной микроскопии известен сайт связывания АЛП на ГАМКАР. В задачи данного проекта входит синтез и оценка биологической активности новых синтетических производных АЛП.
В текущем году мы синтезировали гибридные соединения на основе АЛП и имидазо[1,2-a]пиридинового фармакофора (конъюгаты серии IZP-3α5αTHP). Производные АЛП были модифицированны по 21-му положению стероидного каркаса через линкер варьируемой длины. Наряду с имидазо[1,2-a]пиридинового фармакофором мы использовали краситель BODIPY (конъюгаты серии BODIPY-3α5αTHP) для построения флуоресцентного зонда, способного окрашивать меченые рецепторы. Для оценки биологической активности полученных соединений мы использовали методы анализа in vitro, in silico и in vivo.
При помощи метода patch clamp регистрации ГАМК-индуцированных токов в изолированных клетках Пуркинье мозжечка мы показали, что вещества серии BODIPY-3α5αTHP потенцируют ГАМКАР. Были получены электрофизиологические характеристики (ЕС50, Еmax) для веществ этой серии и установлена зависимость потенциирующего эффекта от длины линкера. Наиболее активное соединение BODIPY-3α5αTHP III вызывало дозозависимое усиление ГАМК-ергических токов с максимальным эффектом 380±26%. Эксперименты по конкурентному взаимодействию BODIPY-3α5αTHP III и общего анестетика этомидата показали наличие синергического (сверхаддитивного) потенцирующего эффекта при совместной аппликации веществ. Таким образом, несмотря на снижение эффективности по сравнению с 3α5αTHP, BODIPY конъюгаты проявили выраженную селективность к сайту связывания АЛП с ГАМКАР.
Известно, что имидазо[1,2-a]пиридины связываются в экстраклеточной части межсубъединичного α(+)/γ(-) интерфейса ГАМКАР. При помощи метода вытеснения меченого [3H]Флунитразепама из экстрактов мембран нейронов мозга крысы мы показали, что вещества серии IZP-3α5αTHP связываются с бензодиазепиновым сайтом ГАМКАР. Эффективность вытеснения зависит от длины линкера. Наиболее активным со значением IC50 = 397 нМ в серии было производное IZP-3α5αTHP IV, характеризующее самым длинным линкером. Молекулярная динамика (МД) веществ этой серии в водном растворе показала, что предпочтительной конформацией IZP-3α5αTHP IV является развернутая, что облегчает связывание имидазо[1,2-a]пиридинового фармакофора с бензодиазепиновым сайтом ГАМКАР.
Мы использовали крио-ЭМ структуру 6X3Z α1β2γ2 ГАМКАР в вычислительных экспериментах по поиску оптимальных мод связывания изучаемых гибридов с рецептором. Метод молекулярной механики был использован для докинга гибридов в нейростероидный сайт связывания ГАМКАР. Молекулярная динамика (МД) была использована для изучения конформационной стабильности моделей как самого ГАМКАР, так и комплексов гибрид-рецептор. Расчеты МД выполнены в полно-атомном приближении при температуре 300 К на основе силового поля CHARMM36 с использованием модели явного растворителя. Модель ГАМКАР была встроена в двойной слой липидной мембраны POPC размером 110х110 Å.
Мы показали, что связывание BODIPY-3α5αTHP конъюгатов с нейростероидным сайтом не зависит существенно от длины линкера. Несмотря на то, что при связывании происходит значительное изменение положения фрагмента 3α5αTHP конъюгата в сайте связывания по сравнению с крио-ЭМ структурой 8SI9 ГАМКАР+АЛП, комплекс гибрид-рецептор остается стабильным. Прочные контакты с остатками α1 W246 и L301, и β2 Y304, характерные для связывания 3α5αTHP сохраняются. Наша модель предсказывает, что фрагмент линкер+BODIPY в составе конъюгата BODIPY-3α5αTHP III не препятствует связыванию фрагмента 3α5αTHP с нейростероидным сайтом в трансмембранном сегменте межсубъединичных β(+)/α(-) интерфейсов. Таким образом, на примере конъюгатов BODIPY-3α5αTHP мы показали, что введение функционального фрагмента в 21-е положение 3α5αTHP через аминокислотный линкер не приводит к потере возможности нейростероидного фармакофора связываться с мишенью в нейрональных клетках. Эти результаты могут быть экстраполированы и на вещества серии IZP-3α5αTHP сходного с BODIPY-3α5αTHP дизайна.
К сожалению, оценка анксиолитических эффектов серии полученных гибридных молекул in vivo в тесте «Новый аквариум» на модельных животных - рыбах вида Danio rerio не вызывали статистически достоверных изменений в характере поведения рыб, что, наиболее вероятно, было связано с низкой растворимостью гибридных структур в водных растворах.
Нейростероиды регулируют многие функции нервной системы и играют важную биологическую роль в развитии мозга и его функционировании. Это позволяет рассматривать нейроактивные стероиды и их производные в качестве новой многообещающей группы препаратов, которые могут быть использованы для лечения заболеваниий нервной системы. Достоинством предложенной оригинальной стратегии создания конъюгатов 3α5αTHP с использованием линкеров на основе природных аминокислот является возможность в перспективе контролируемо изменять ключевые характеристики гибридных молекул, включая их липофильность и фармакокинетические параметры, что также важно для биологических исследований связанных с нейростероидами процессов в ЦНС.