Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В результате исследований собран de novo полный геном C. sphaeroides ВКМ B-3534D. Показано, что метаболические возможности синтеза звеньев цикла трикарбоновых кислот у исследуемых штаммов C. sphaeroides (B-3534D, 2.4.1, ATCC 17029, KD131) отличаются от таковых у R. capsulatus B10 отсутствием глиоксилатного шунта, метилцитратного цикла и части путей образования пирувата из экзогенного ацетата и CO2, а также наличием генов цитрамалатного цикла и сукцинил-КоA:ацетат КоA-трансферазы. Проведено сравнение трех геномов независимых линий пурпурной несерной бактерии R. capsulatus, являющихся производными одного родительского штамма B10, но поддерживающихся в коллекциях разных научных коллективов более 40 лет. Один из геномов секвенирован и собран de novo в рамках данной работы. Выявлено, что линии отличаются между собой размером геномов, количеством дополнительных плазмид, локализацией генов на плазмиде или хромосоме и количеством кодирующих областей. Было проведено изучение экспрессиии генов анаплеротических путей у R. capsulatus B10 (ИЦЛ+) и C. sphaeroides ВКМ B-3534D (ИЦЛ-) в фотогетеротрофных анаэробных (без экзогенного СО2) и хемогетеротрофных аэробных условиях выращивания с использованием малата или ацетата. Изучали экспрессию следующих генов: изоцитратлиазы в глиоксилатном шунте, кротонил-КоА-редуктаза/карбоксилазы в этил-малонилкоА пути, РУБИСКО в цикле Кальвина-Бенсона-Бэссема и фотодыхании, пируватсинтазы из нескольких СО2-зависимых путей, а также генов ответственных за образование звеньев ЦТК из образовавшихся в них метаболитов – глиоксилата (в малат за счет малил-КоА/цитрамалил-КоА лиазы в сочетании с малил-КоА-тиоэстеразой; и малатсинтазы), пропионил-КоА (с участием пропионил-КоА карбоксилазы); фосфоенолпирувата (фосфоенолпируватгидратазы/енолазы), пирувата (пируваткарбоксилазы). Пробы на анализ отбирались в фазе активного роста бактерий после второго пересева в соответствующие условия культивирования. Проведенные эксперименты показали, что после второго пересева на среду с ацетатом в фототрофных условиях у ИЦЛ+ и ИЦЛ- бактерий скорость роста сопоставима, но в 3 раза меньше, чем на среде с малатом в этих же условиях. В аэробных условиях рост C. sphaeroides ВКМ B-3534D в присутствии ацетата был примерно в 2 раза медленнее, чем у R. capsulatus B10. На среде с малатом в аэробных условиях обе культуры росли быстрее и достигали стационарной фазы примерно за сутки. Анализ экспрессии генов этилмалонил-КоА пути (crr, pcc, mcl1 и mcl2) в образцах культур C. sphaeroides ВКМ B-3534D показал наличие его транскриптов во всех условиях выращивания, что согласуется с литературными данными, указывающими на его конститутивное присутствие в клетках. В малатных аэробных и фототрофных культурах C. sphaeroides ВКМ B-3534D уровень транскриптов для этого пути был выше по сравнению с ацетатными культурами в аналогичных условиях роста. В анаэробных фототрофных и в аэробных темновых условиях роста на среде с ацетатом наблюдалось увеличение уровня экспрессии гена пируваткарбоксилазы (pycA) у культуры C. sphaeroides ВКМ B-3534D в сравнении с малатными культурами. Это свидетельствует о важной роли образования оксалоацетата ЦТК из пирувата в пополнении пула интермедиатов ЦТК. Транскрипты генов двух форм РУБИСКО (cbbL и rbpL), ключевого фермента цикла Кальвина-Бенсона-Бэссема, присутствуют в образцах. Таким образом, об активности пути синтеза интермедиатов ЦТК из пирувата можно косвенно судить по измеренной дополнительно к плану экспрессии гена пируваткарбоксилазы. В анаэробных малатных культурах C. sphaeroides ВКМ B-3534D, по сравнению с ацетатными, наблюдается более чем двукратное увеличение уровня экспрессиии генов РУБИСКО. Однако транскрипты генов фосфоенолпируватгидратазы/енолазы (eno) и пируваткарбоксилазы (pycA) находятся на низком уровне, что свидетельствует об использовании фосфоглицерата, синтезируемого РУБИСКО, в синтезе углеводов. Важно отметить, что транскрипты генов РУБИСКО, которые, по литературным данным, экспрессируются только в анаэробных или микроаэрофильных условиях роста, обнаруживаются и в аэробных культурах C. sphaeroides ВКМ B-3534D. Это может быть связано с тем, что активно растущая культура поглощает кислород с высокой скоростью и культуры в наших экспериментах могли находиться в микроаэробных условиях. Ген glcB малатсинтазы G присутствует у ИЦЛ- C. sphaeroides ВКМ B-3534D, других вариантов малатсинтаз в геноме нет. У R. capsulatus B10 имеется две малатсинтазы G (glcB) и B (aceB). Ген aceB локализован у бактерии в одном опероне с изоцитратлиазой (aceA), т.е. продукт гена функционирует в глиоксилатном шунте. Транскрипты гена glcB присутствуют в культурах C. sphaeroides ВКМ B-3534D во всех анализируемых условиях выращивания, но продукт этого гена не функционирует в глиоксилатном шунте. Так как один из ключевых генов (mcl2), связанный с образованием S-цитрамалил-КоА в цитрамалатном цикле, также ответственен за реакции в других анаплеротических путях (этилмалонил-КоА пути, метилцитратном цикле, а также в альтернативном треонинзависимом пути синтеза разветвленных аминокислот), то выводов о его функционировании только по экспрессии делать нельзя. Необходим анализ полного транскриптома C. sphaeroides ВКМ B-3534D в условиях, использованных нами. У культур R. capsulatus B10, как и у C. sphaeroides ВКМ B-3534D, транскрипты генов этилмалонил-КоА пути (crr, pccA, citE2 и citE1) синтезируются конститутивно во всех изученных условиях. Было отмечено, что в анаэробных фототрофных малатных культурах, по сравнению с фототрофными ацетатными, были достоверно повышены уровни экспрессии малатсинтазы G (glcB), пропионил-КоА карбоксилазы (pccA), малил-КоА тиоэстеразы (citE1) и пируват:оксидоредуктазы/пируватсинтазы (nifG). По сравнению с результатами кПЦР-анализа малатной аэробной культуры, фототрофная анаэробная демонстрирует достоверное увеличение уровней транскрипции более чем в 2 раза практически для всех анализируемых генов. Таким образом, несмотря на наличие активных анаплеротических путей обе исследуемые культуры характеризуются замедленным ростом на ацетате, что может объясняться лимитированием СО2-зависимых реакций субстратом в используемых нами условиях. Сравнение полученных в отчетный период результатов с данными об экспрессии генов для культур, использующих помимо органических кислот дополнительно внесенный СО2, позволит составить полную картину об особенностях метаболизма ацетата у ИЦЛ+ и ИЦЛ- бактерий.