Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В рамках исследования были выделены и охарактеризованы высокоочищенные фукоиданы из пяти видов бурых водорослей: Saccharina bongardiana (SbF), Fucus evanescens (FeF), Saccharina cichorioides (ScF), Kjellmaniella crassifolia (KcF) и Undaria pinnatifida (UpF). Структурный анализ подтвердил их принадлежность к различным типам полисахаридов. Фракция FeF представляет собой (1→3;1→4)-α-L-фукоидан, тогда как ScF, KcF и SbF имеют схожее строение основных цепей и идентифицированы как (1→3)-α-L-фукоиданы. UpF является сульфатированным фукогалактаном сложного строения, в котором остатки L-Fuc и D-Gal соединены α-1→3-, α-1→4- и α-1→6-О-гликозидными связями с различным расположением сульфатных заместителей. Для деполимеризации и модификации профиля сульфатирования полученных фукоиданов были применены химические, ферментативные и хемоэнзиматические подходы, которые позволили получить 29 производных различной структуры. В результате применения мягкого кислотного гидролиза была получена серия из 9 средне- и низкомолекулярных производных фукоиданов FeF, ScF, KcF и UpF с выходами 17–59%. При действии перекиси водорода получено 5 низкомолекулярных производных из FeF, ScF, KcF и UpF, выход которых варьировался в диапазоне 35–90%. Для направленной модификации фукоидана FeF были использованы высокоспецифичные рекомбинантные ферменты: эндо-фуканазы (FWf1, FWf2, FWf3, FWf4), эндо-4-О-сульфатаза SWF5, а также ранее неизвестные эндо-3-О- и эндо-4-О-деацетилазы AcWf2 и AcWf1. Открытие фукоидан-эндо-деацетилаз позволило реализовать хемоэнзиматический подход, основанный на использовании ацетильной группы в качестве универсальной защиты для региоселективного введения сульфатных групп в полимерную цепь полисахарида. Комбинированное применение эндо-4-О-сульфатазы, эндо-4-О- и эндо-3-О-деацетилаз, а также химического ацетилирования и сульфатирования позволило получить 6 производных фукоидана FeF с заданным расположением ацетатных и сульфатных групп. В результате действия эндо-фуканаз, селективных к различному сульфатированию, была получена серия из 8 низкомолекулярных и среднемолекулярных производных фукоидана FeF с выходами 25–57%. Структурные характеристики полученных производных фукоиданов были определены с помощью комбинации химических, физико-химических и физических методов исследования. Профиль сульфатирования в фукоиданах был определен с применением нового подхода, основанного на количественном анализе действия набора высокоспецифичных эндо-фуканаз. Этот способ позволил количественно определить содержание 2,3-ди-, 2,4-ди- и 2-сульфатирования. Для оценки связывания исследуемых соединений с P-селектином была создана клеточная модель HEK293/p-sel со стабильной экспрессией целевого белка. Наиболее эффективное взаимодействие продемонстрировали низкомолекулярные производные, полученные методом мягкого кислотного гидролиза. Среди среднемолекулярных фракций максимальной связывающей способностью обладало производное FeF-H-W4. В ходе оценки влияния фукоиданов на тромбоциты установлено, что все немодифицированные высокомолекулярные фукоиданы, независимо от их структурного типа, проявляют выраженные проагрегантные свойства. Агрегационная активность образцов FeF, ScF, KcF и UpF достигала 73–84%, что сопоставимо с эффектом 20 мкМ АДФ (78–100%). Деполимеризация в большинстве случаев приводила к ослаблению проагрегантных свойств. Наиболее заметно этот эффект проявлялся у производных (1→3;1→4)-α-L-фукоиданов, где уровень агрегации снижался минимум на 45%. При этом остаточная агрегационная способность низко- и среднемолекулярных производных (1→3;1→4)-α-L-фукоиданов коррелировала с наличием 2,4-ди-сульфатирования, а для (1→3)-α-L-фукоиданов и фукогалактанов — с общим содержанием сульфатных групп. Ферментативные производные (1→3;1→4)-α-L-фукоидана FeF-H-W2, FeF-H-W4, FeF-H-W3 и FeF-L-W3, в отличие от производных (1→3)-α-L-фукоиданов и фукогалактанов, в концентрации 100 мкг/мл достоверно влияли на скорость АДФ-опосредованной агрегации тромбоцитов, что представляет интерес для купирования непродолжительных протромботических стимулов. Взаимодействие фактора Виллебранда (vWF) с тромбоцитарным гликопротеином GPIb играет важную роль в адгезии и активации тромбоцитов, инициируя тромбообразование в условиях высокого напряжения сдвига. Установлено, что немодифицированные фукоиданы в концентрации 100 мкг/мл проявляли максимальную активность, ингибируя процесс взаимодействия vWF-GPIb на 22–75%, тогда как низкомолекулярные производные были менее эффективны. Было оценено влияние фукоиданов и их производных на процессы свёртывания плазмы крови. Установлено, что для (1→3;1→4)-α-L-фукоиданов ключевыми структурными детерминантами являются молекулярная масса и расположение сульфатных групп. Снижение молекулярной массы приводит к снижению активности, тогда как высокое содержание 2,4-ди-сульфатирования ее повышает. При этом негативный эффект от снижения молекулярной массы может быть скомпенсирован 2,4-ди-сульфатированными мотивами. Эта закономерность также наблюдалась в тестах ингибирования факторов Xa/IIa (в присутствии AT-III), указывая на преимущественно серпин-зависимый механизм действия фукоиданов. Молекулярная масса и содержание сульфатных групп также были ключевыми детерминантами антикоагулянтных эффектов (1→3)-α-L-фукоиданов и фукогалактанов. Впервые показано, что взаимное расположение ацетильных и сульфатных заместителей способно существенно изменять антикоагулянтные свойства (1→3;1→4)-α-L-фукоиданов. Максимальный антикоагулянтный эффект наблюдался при сочетании 3-О-ацетилирования с 2,4-ди-сульфатированием. Производное FeF2,4S3Ac с таким профилем замещения демонстрировало наивысшую активность среди всех исследованных образцов фукоиданов, которая в 3–4 раза превосходила активность препарата сравнения — Клексана. Большинство фукоиданов не оказывали существенного влияния на протромбиновое время (индикатор ингибирования внешнего пути свертывания). Исключением являлись FeF2,4S3Ac, фукогалактан UpF и некоторые из его производных, что сопряжено с потенциальным риском геморрагических осложнений при системном применении. По итогам реализации первого этапа проекта продемонстрирован потенциал химических, ферментативных и хемоэнзиматических подходов для направленной модификации фукоиданов. Для дальнейших исследований in vivo в качестве наиболее перспективного кандидата отобрано производное FeF-H-W4, которое демонстрирует оптимальный баланс профиля безопасности, высоких антикоагулянтных и антиагрегантных свойств, а также обладает подтвержденной способностью к взаимодействию с P-селектином.