Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Определение антимикробного потенциала лектинов двустворчатых моллюсков проводили на условно патогенных микроорганизмах: грамположительных бактериях Staphylococcus aureus КММ 434 и грамотрицательных бактериях Escherichia coli КММ 8450. CGL и MTL, Gal-специфичные лектины, были выделены из мантий мидий Crenomytilus grayanus и Mytilus trossulus, муцин-специфичный лектин GYL и рамнозоспецифичный лектин GYL-R, выделены из гемолимфы двустворчатого моллюска Glycymeris yessoensis. Оценку влияния лектинов на формирование бактериальных биоплёнок проводили с использованием классического метода количественного определения с красителем кристаллическим фиолетовым. Установлено, что CGL достоверно ингибирует формирование биоплёнки S. aureus во всех исследованных концентрациях. Снижение биомассы биоплёнки достигало 55% при максимальном содержании лектина. Влияние CGL на биоплёнки, формируемые E. coli, было менее выраженным — уменьшение биомассы составляло около 34%. GYL также ингибирует формирование биоплёнок обоих исследованных видов бактерий. При концентрации 250 мкг/мл наблюдалось снижение формирования биоплёнки S. aureus на 58% и E. coli на 23%. Наибольшая ингибирующая активность лектина GYL-R отмечалась при концентрации 1000 мкг/мл, при которой образование биоплёнки S. aureus снижалось на 28%, а E. coli — на 30%. Исследование антибиоплёночной активности показало, что все три изученных лектина проявляли способность разрушать уже сформированные зрелые биопленки. При максимальной концентрации CGL демонстрировал эффективность, сопоставимую с его действием на процесс формирования биоплёнок, разрушая до 58% биоплёнок S. aureus и 28% биоплёнок E. coli. GYL при концентрации 250 мкг/мл снижал биомассу биоплёнки S. aureus более чем на 50%, однако его действие на биоплёнки E. coli было значительно слабее. При максимальной концентрации 1000 мкг/мл уменьшение биомассы не превышало 20%. Лектин GYL-R в максимальной концентрации разрушал сформированные биоплёнки S. aureus на 9%, а в отношении E. coli проявлял более выраженную активность, снижая биомассу биоплёнок на 20%. В экспериментах по определению потенциала лектинов в качестве синергистов антибиотиков был выбран CGL. Механизм синергетического взаимодействия лектинов с антибиотиками остаётся недостаточно изученным. Для уточнения характера взаимодействия было использовано несколько методов: конкурентный твердофазный лектин-ферментный анализ (ТЛФА), термофлуоресцентный анализ и изотермическая титрационная калориметрия (ИТК). Методом ТЛФА установлена минимальная ингибирующая концентрацией (МИК) для положительного контроля (Gal) - 1,4 мг/мл, тогда как Glc, использовавшаяся в качестве отрицательного контроля, не оказывала ингибирующего действия, также как и антибиотики (пенициллин, стрептомицин, левомицитин, ципрофлоксацин и гентамицин). Полученные результаты указывают на отсутствие связывания антибиотиков с углевод-связывающим сайтом лектина. Помимо распознавания и связывания с углеводами, лектины могут взаимодействовать с гидрофобными молекулами во внутренней полости димерных или тетрамерных структур. Однако эти взаимодействия не затрагивают углевод-связывающий домен лектинов. Поскольку известно, что CGL отличается повышенной способностью к олигомеризации, для изучения белок-лигандных взаимодействий был использован термофлуоресцентный анализ. Мы оценили взаимодействие CGL с лигандами: Gal, Glc и антибиотиками, приводящее к изменению температуры плавления (ΔTm). ΔTm в присутствии Gal увеличилось на 11,39 ± 0,31°C, с Glc не изментлась (0,35 ± 0,14°C). Присутствие гентамицина привело к уменьшению ΔTm CGL (-4,43 ± 0,2°C), что свидетельствует о взаимодействии антибиотика с лектином, приводящем к некоторой дестабилиции белка. Метод ИТК, который применяют для количественного изучения взаимодействий «белок–лиганд», показал, что константа диссоциации (Kd) для Gal составляет 1,796 × 10⁻⁴ М при стехиометрии связывания (n) около 3,0. Это указывает на то, что каждый мономер CGL способен связывать три молекулы Gal, что согласуется с установленными методом рентгеноструктурного анализа данными о наличии трёх углевод-связывающих доменов в структуре одного мономера CGL. Отрицательная энтальпия (ΔH = -16,27) указывает на экзотермический характер связывания. Изотерма ИТК взаимодействия гентамицина с CGL указывает на более низкое сродство по сравнению с галактозой. Положительное значение энтальпии (ΔH = 100) свидетельствует об эндотермическом характере взаимодействия гентамицина с лектином. Число сайтов связывания (n) составляло около 4, что превышало количество углевод-связывающих сайтов на одну субъединицу лектина. Это позволяет предположить, что гентамицин взаимодействует с аминокислотными остатками, расположенными вне углевод-связывающих сайтов, что согласуется с результатами ТЛФА и термофлуоресцентного анализа. Для оценки антибактериального эффекта лектина в сочетании с антибиотиком методом турбидиметрии была рассчитана МИК50 для CGL и гентамицина. Для CGL МИК50 оказались одинаковыми для S. aureus и E. coli и составили 250 мкг/мл. МИК50 гентамицина в отношении S. aureus – 1,05мкг/мл и E. coli – 2,09 мкг/мл. Совместное применение CGL и гентамицина вызывало различный эффект в зависимости от бактериального вида. Для комбинации CGL и гентамицина наблюдался синергетический эффект против S. aureus, ΣФИК =0,48 в то время как против E. coli действие носило аддитивный характер ΣФИК =0,98. Сочетание гентамицина и CGL усиливало антибактериальную активность антибиотика против S. aureus, снижая значение МИК50 в 2,8 раза. Эти результаты подчеркивают потенциальные возможности биомедицинского применения CGL. Ингибирование инфекции S. aureus и E. coli лектинами in vivo проводили на модели эмбрионов морского ежа Strongylocentrotus nudus. Лектины не оказывали цитотоксического действия на оплодотворенные яйцеклетки ежа. Кроме того, GYL-R, GYL, CGL и MTL показали протекторную активность. При совместном применении CGL с гентамицином на эмбрионах морского ежа, инфицированных S. aureus, лектин оказывает синергетический эффект, существенно повышая выживаемость эмбрионов. После инфицирования S. aureus развитие большинства эмбрионов замедлялось более чем на 50% или они замирали. При совместном добавлении S. aureus и CGL доля аномалий снизилась, количество развившихся составило 66,3% по сравнению с 94,9% в контрольной группе. Аналогичный эффект наблюдался при добавлении гентамицина к инфицированным эмбрионам, в этой группе до 16 бластомеров развилось 61,7% эмбрионов. Наиболее выраженный защитный эффект отмечен при совместном применении CGL и гентамицина (76,3% эмбрионов развилось до 16 бластомеров) — при этом только около 20% эмбрионов демонстрировали нарушение развития. Добавление только CGL или только гентамицина к неинфицированным эмбрионам не оказывало заметного влияния на эмбриональное развитие.