КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер проекта 25-25-00238
НазваниеГетеродимерные комплексы серотониновых 5-HT7 и тирозинкиназных TrkB рецепторов как мишень для лечения депрессивных расстройств
Руководитель Ильчибаева Татьяна Витальевна, Кандидат биологических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук" , Новосибирская обл
Конкурс №102 - Конкурс 2025 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами»
Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-106 - Нейробиология
Ключевые слова Серотониновые рецепторы, тирозинкиназные рецепторы, BDNF, гетеродимерные комплексы, депрессивно-подобное поведение
Код ГРНТИ34.15.43
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Ожидаемые результаты
В ходе реализации проекта будут сконструированы плазмиды со вставкой гена рецептора TrkB и метки EGFP и плазмиды со вставкой гена 5-HT7 рецептора и меткой HA-tag. Клетки нейробластомы N1E-115 будут трансфицированы полученными плазмидами по отдельности или совместно, после чего методом коиммунопреципитации будут выявлены комплексы рецепторов в клеточных лизатах. Затем будут созданы плазмиды, кодирующие 5‐HT7‐mTurquoise2 и TrkB‐YPet, выполняющие функции донора и акцептора. Клетки нейробластомы N1E-115 будут трансфицированы данными плазмидами и в дальнейшем, методом FRET, будет показано физическое взаимодействие между исследуемыми рецепторами. Методом коиммунопреципитации наличие межрецепторных комплексов будет показано in vivo в образцах гиппокампа, фронтальной коры и среднего мозга мышей C57Bl/6.
Подтвердив наличие гетеродимерных комплексов in vitro и in vivo, мы продемонстрируем изменение базового фосфорилирование и функционального ответа TrkB рецептора в ответ на активацию селективным агонистом в присутствии 5-НТ7 рецептора в клетках N1E-115. Для этого клетки нейробластомы будут ко-трансфицированы плазмидами кодирующими оба рецептора и подвергнуты обработке рекомбинантным белком BDNF c последующей оценкой уровней фосфорилирования TrkB рецептора и митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK).
Затем мы покажем, как фосфорилирование TrkB рецептора и MAPK меняется в котрансфицированных клетках N1E-115 при фармакологической активации 5-НТ7 рецептора высокоселективным агонистом LP-211.
На взрослых самцах мышей линии C57Bl/6 будет показан эффект острой активации 5-НТ7 рецепторов агонистом LP-211 или блокады антагонистом SB-269970, а также блокады TrkB селективным антагонистом ANA-12 в комбинации с LP-211 на уровень фосфорилирования TrkB рецепторов в гиппокампе, фронтальной коре и среднем мозге.
Также мы оценим антидепрессантный эффект длительной активации 5-НТ7 рецепторов, путём введения агониста LP-211 мышам линии ASC (Antidepressant sensitive cataleptics), представляющих собой модель генетически детерминированного депрессивно-подобного поведения. У мышей будет проанализирована двигательная активность, выраженность депрессивно-подобного поведения, тревожность, а также память и обучение. Также в структурах головного мозга будет оценён уровень фосфорилирования TrkB рецепторов, а также МАРК.
Таким образом, с помощью иммунологических и биофизических методов in vitro, а также двух последовательных экспериментах in vivo мы продемонстрируем не только существование 5-HT7-TrkB комплексов, но и их функциональную значимость в головном мозге и покажем роль гетеродимеризации между исследуемыми рецепторами для коррекции депрессивно-подобного фенотипа. Полученные данные существенно продвинут не только наше понимание фармакологии самих рецепторов, но и позволит пересмотреть и модифицировать существующие стратегии терапии депрессивных расстройств.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В ходе настоящего исследования впервые получены прямые экспериментальные доказательства специфического физического взаимодействия между G‑белок‑сопряженным серотониновым рецептором 5‑HT7 и тирозинкиназным TrkB рецепторами. Актуальность данной работы определяется необходимостью выявления молекулярных механизмов, лежащих в основе сложной перекрестной регуляции серотонинергической и нейротрофиновой систем, которые совместно опосредуют процессы синаптической пластичности, нейрогенеза и формирования эмоционального состояния.
Для детекции взаимодействия были созданы плазмидные конструкции, экспрессирующих мышиные рецепторы 5-HT7 и TrkB, меченные эпитопными (HA) или флуоресцентными (EGFP, mTurquoise2, YPet) метками. В клетках нейробластомы N1E‑115 совместная экспрессия 5‑HT7 с HA‑меткой и TrkB с EGFP‑меткой позволила детектировать устойчивые комплексы методом ко‑иммунопреципитации. Критически важный контроль, исключающий артефакт агрегации белков в процессе солюбилизации — смешивание лизатов клеток, экспрессирующих рецепторы по отдельности, — не приводил к ко-преципитации, подтверждая специфичность наблюдаемого взаимодействия.
Для независимого подтверждения факта сближения рецепторов в нативной липидной мембране без стадии лизиса был применен биофизический метод Фёрстеровского резонансного переноса энергии (FRET). В живых клетках N1E-115, коэкспрессирующих рецепторы, меченные парой флуорофоров-донор-акцептор (5-HT7-mTurquoise2 и TrkB-YPet), была зафиксирована высокая кажущаяся эффективность FRET (EfDA = 18.6%), что свидетельствует о стабильном нанометровом (<10 нм) сближении рецепторов. Значимо более низкий сигнал FRET, зарегистрированный для контрольной пары белков CD86, подтвердил, что наблюдаемый эффект обусловлен именно специфическим взаимодействием рецепторов 5-HT7 и TrkB, а не случайной диффузией в плоскости мембраны.
Ключевым этапом работы стало доказательство существования данных гетеромерных комплексов в головном мозге мышей. Методом ко-иммунопреципитации из гомогенатов ключевых областей мозга взрослых мышей линии C57Bl/6J (гиппокамп, фронтальная кора, средний мозг) с использованием антител к эндогенному рецептору 5-HT7 и последующей вестерн-блот детекцией TrkB были однозначно идентифицированы стабильные белковые комплексы, содержащие оба рецептора. Этот результат подтвердил физиологическую релевантность взаимодействия, первоначально обнаруженного в рекомбинантной системе.
Таким образом, комбинацией методов in vitro (ко-иммунопреципитация и количественный FRET) и анализа in vivo впервые установлен факт образования специфических гетеромерных комплексов между 5-HT7 и TrkB рецепторами. Полученные результаты вводят новую гетеромерный комплекс 5-HT7–TrkB — в современную парадигму внутриклеточной сигнализации. Образование такого комплекса предполагает возможность прямого аллостерического влияния одного рецептора на лиганд-связывающие или каталитические свойства другого, что представляет собой более эффективный и селективный механизм кросс-регуляции по сравнению с конвергенцией сигнальных путей на уровне вторичных мессенджеров. Обнаруженный гетеромер является принципиально новой мишенью для фармакологического воздействия. Перспективным направлением представляется разработка бивалентных лигандов или аллостерических модуляторов, избирательно влияющих на стабильность или функциональную активность данного комплекса, что может открыть новые стратегии для терапии заболеваний, ассоциированных с дисфункцией серотонинергической и нейротрофиновой систем, таких как депрессия, тревожные расстройства и нейродегенеративная патология.