Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В течение первого года выполнены ключевые этапы, предусмотренные планом проекта. Поставлена и отработана in vivo модель опухоли путём подкожного введения клеток линии меланомы B78-21 мышам-самцам линии C57Bl6. Произведён забор органов у контрольных и экспериментальных животных (селезенки), у экспериментальных мышей-опухоленосителей также забирали ткань опухоли для анализа. Из клеток селезенки с высокой чистотой (90%+) выделены две группы эритробластов: CD45+ и CD45- эритробласты. В дальнейшем CD45+ и CD45- эритробласты использовали для приготовления библиотек ATAC-seq для профилирования участков открытого хроматина и RRBS-seq для оценки метилирования ДНК с использованием коммерческих наборов в соответствии с инструкциями производителей. На момент написания отчета NGS-библиотеки переданы на секвенирование. У выделенных клеток селезенки и клеток опухолевой ткани оценивали фенотипические параметры, то есть поверхностные (TER119, CD45, Galectin-3, Galectin-9, CXCR4, PDL1) и внутриклеточные (TGFb, IL10, MCP1) белковые молекулы методом проточной цитометрии. Найдено, что общее содержание эритробластов в разных тканях при разных состояниях организма у мыши меняется. В частности, у мышей-опухоленосителей процентное содержание эритробластов в селезенке составляет 3,48% (медиана) от всех клеток селезенки, что статистически достоверно больше по сравнению со здоровыми (контрольными) мышами, у которых процентное содержание эритробластов в селезенке составляет 1,95% (медиана). В опухолевой ткани у мышей-опухоленосителей процентное содержание эритробластов в селезенке составляет 3,78% (медиана), но статистически не отличается от содержания эритробластов в селезенке мышей-опухоленосителей. Оценка фенотипических характеристик эритроидных клеток мыши проточной цитометрией показала, что селезеночные эритробласты контрольных (здоровых) животных и экспериментальных мышей-опухоленосителей по исследованным маркерам статистически достоверных различий не имеют. Однако, внутриопухолевые CD45+ эритроидные клетки в сравнении с контрольной группой имеют повышенную экспрессию иммуносупрессивных молекул PD-L1 и галектина 3, а также хемокинового рецептора CXCR4 (CD184). Вероятно, это свидетельствует об активном участии эритробластов в создании и поддержании опухолевого микроокружения. Для части проекта касающейся клеток человека в целях обеспечения готовности ко второму году собраны образцы костного мозга и выполнено исследование поверхностных и внутриклеточных маркеров клеток костного мозга методом проточной цитометрии. Для сохранения и последующего использования мононуклеарные клетки костного мозга замораживали в жидком азоте по стандартной методике. Окрашивание клеток для цитометрии проводили по стандартной методике с использованием коммерческих антител по следующим поверхностным маркерам: CD71, CD235a, CD45, CD36, Galectin-3, CXCR4 (CD184), CD49d,также проводили внутриклеточное окрашивание молекулы фермента аргиназы-1. Фенотипическая характеристика эритроидных клеток костного мозга человека (здоровых доноров) показала, что эритробласты человека разделяются на две группы CD36+ и CD36-. Среди CD36+ эритробластов в основном выявлены более незрелые формы (проэритробласты, базофильные эритробласты), а среди CD36- в основном выявлены более зрелые формы (полихроматические, оксифильные эритробласты). Также цитометрический анализ показал наличие CD45+ эритроидных клеток среди клеток человека, которые также как и аналогичные клетки мыши имели высокую экспрессию хемокинового рецептора CXCR4 (CD184). Однако, у человека CD45+ эритробласты практически не несут на своей поверхности молекулы галектин 3. Немаловажно заметить, что при кластерировании выделяется отдельный, пусть и небольшой, кластер CD45+эритроидных клеток положительных по внутриклеточному маркеру аргиназе-1. Для этих аргиназа-1 положительных клеток характерно, что они все относятся к кластеру оксифильных эритробластов, то есть являются довольно зрелыми ядерными клеточными формами эритрона. Полученные результаты по фенотипам клеток эритроидного ряда и их иммунорегуляторным признакам опубликованы в публикации (https://doi.org/10.3390/biomedicines13051218) и служат методологической и биологической базой для предстоящей эпигеномной работы.