КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер проекта 25-25-00369
НазваниеСоздание панели рекомбинантных клеточных линий для определения взаимодействия новых лекарственных средств с основными белками-транспортерами
Руководитель Абаленихина Юлия Владимировна, Доктор медицинских наук
Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова" Министерства здравоохранения Российской Федерации , Рязанская обл
Конкурс №102 - Конкурс 2025 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами»
Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-401 - Молекулярная и клеточная медицина
Ключевые слова белки-транспортеры, Pgp, BCRP, ОАТР1В1, ОАТР1В3, ОСТ2, ОАТ1, ОАТ3, клеточные линии
Код ГРНТИ76.03.00
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Ожидаемые результаты
В ходе реализации проекта будут созданы клеточные линии, гиперэкспрессирующие клинически значимые белки- транспортеры: полипептид, транспортирующий органические анионы ОАТР1В3, транспортер органических анионов ОАТ1, транспортер органических анионов ОАТ3, транспортер органических катионов ОСТ2. В настоящее время коллективом авторов создана клеточная линия, гиперэкспрессирующая полипептид, транспортирующий органические анионы ОАТР1В1, соответственно по аналогии будут созданы и другие клеточные линии.
В ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН будут созданы генетические конструкции для гиперэкспрессии выше перечисленных транспортеров в эукариотических клеточных линиях, отработаны протоколы трансфекции клеток линии HEK293 и скрининга линии на вставку целевого гена в клеточный геном.
В ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России будет выполняться трансфекция клеток HEK293 экспрессионными векторами в соответствии с разработанными протоколами, проводиться селекция клеток, несущих целевые гены, а также проведен анализ, подтверждающий продукцию целевых белков и оценка их активности по транспорту специфических субстратов.
С помощью разработанных клеточных линий на базе ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России будет протестирован оригинальный отечественный лекарственный препарат: этилметилгидроксипиридина сукцинат на принадлежность к субстратам и ингибиторам изучаемых белков-транспортеров (выбор препарата обусловлен его разработкой в России, отсутствием данных по принадлежности к субстратам/ингибиторам данных белков- транспортеров, а также широким применением в клинической практике).
Разработанные клеточные линии будут использоваться в дальнейшем для тестирования и других новых оригинальных отечественных препаратов на взаимодействие с белками-транспортерами, что необходимо для соответствия требованиям международных стандартов оценки безопасности новых лекарственных препаратов. Проведенные исследования позволят повысить безопасность терапии с использованием данных лекарственных препаратов.
Кроме того, созданные клеточные линии, селективно гиперэкспрессирующие данные белки-транспортеры, можно использоваться для изучения особенностей функционирования и регуляции данных белков-транспортеров.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Транспортные белки OATP1B3 (organic anion transporting polypeptide 1B3) и OCT2 (Organic Cation Transporter 2) играют ключевую роль в фармакокинетике множества лекарственных веществ, определяя их проникновение в гепатоциты-клетки печени (OATP1B3) и эпителиальные клетки почечных канальцев (OCT2) соответственно. Активность данных транспортеров напрямую влияет на терапевтическую эффективность и токсичность их субстратов. In vitro модели на основе клеточных линий, селективно экспрессирующих конкретные транспортеры, являются золотым стандартом для изучения их участия в транспорте лекарственных веществ.
В ходе выполнения первого года проекта были получены следующие результаты:
1. Созданы экспрессионные плазмиды с генами, кодирующими полипептид, транспортирующий органические анионы ОАТР1В3 (OATP1B3-T2A-pEGFP) и транспортер органических катионов ОСТ2 (OCT2-T2A- pEGFP).
2. C помощью липофекции с последующей селекцией и клонированием созданы клеточные линии HEK293-OATP1B3 и HEK293-OCT2, перманентно экспрессирующие целевые белки-транспортеры ОАТР1В3 и ОСТ2 соответственно.
3. Оценена экспрессия генов, кодирующих изучаемые белки транспортеры, в созданных клеточных линиях HEK293-OATP1B3 и HEK293-OCT2 методом ПЦР в реальном времени.
4. Выполнена детекция целевых белков OATP1B3 и OCT2 и полуколичественный анализ их содержания в трансфицированных клеточных линиях HEK293-OATP1B3 и HEK293-OCT2, с предварительной валидацией метода вестерн-блот.
5. Разработана и валидирована методика одновременного количественного определения субстратов всех изучаемых транспортеров – OATP1B3, OCT2, OAT1, OAT3 – аторвастатина, амантадина, аминогиппуровой кислоты, ацикловира и эстрон-3-сульфата. Чувствительности данной методики достаточно для определения транспорта данных веществ внутрь клеток при выполнении транспортных экспериментов.
6. Оценена активность изучаемых белков в созданных клеточных линиях HEK293-OATP1B3 и HEK293-OCT2 по анализу транспорта их субстратов аторвастатина и амантадина внутрь клеток в сравнении с интактными клетками HEK293. Установлено, что в созданных клеточных линиях изучаемые транспортеры OATP1B3 и OCT2 являются функционально активными.
6. Проанализирована принадлежность этилметилгидроксипиридина сукцината (ЭМГПС) к субстратам/ингибиторам OATP1B3 и OCT2.
Полученные клеточные линии представляет собой функциональный инструмент для изучения участия белков транспортеров OATP1B3 и OCT2 в трансмембранном переносе эндогенных и экзогенных веществ, в том числе и лекарственных препаратов.
Публикации
1.
Абаленихина Ю.В., Щулькин А.В., Мыльников П.Ю., Сучкова О.Н., Ананьева П.Д., Якушева Е.Н.
Трансфицированные клеточные линии для оценки транспорта эндогенных веществ.
Издательство Общество с ограниченной ответственностью "Институт новых информационных технологий", Москва, с.120-123 (год публикации - 2025)
10.47501/978-5-6044060-5-2.120-123
2. Абаленихина Ю.В., Ананьева П.Д., Микрюкова Е.Д., Мыльников П.Ю., Щулькин А.В., Мезина А.Е., Якушева Е.Н. Структурно-функциональная биохимия OATP1B3: от полиморфизмов к терапевтическим мишеням. Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. павлова, Том 33 №4 (год публикации - 2025)
3. Щулькин А.В., Абаленихина Ю.В., Ананьева П.Д., Мыльников П.Ю., Якушева Е.Н. Создание панели клеточных линий для изучения роли белков сборник тезисов I Пленума фармакологов России, посвященный 160-летию со дня рождения академика Н.П. Кравкова / под ред. Е.Н. Якушевой. – Рязань: ОТС и ОП, 2025., c.118-119 (год публикации - 2025)
4.
Абаленихина Ю.В., Щулькин А.В., Ананьева П.Д., Мыльников П.Ю., Солотнова С.О., Зацаринная Е.А., Якушева Е.Н.
Вестерн-блот анализ как метод контроля эффективности трансфекции клеток HEK293-SLCO1B3
Прикладные информационные аспекты медицины
, Т. 28, №3. С. 77-84 (год публикации - 2025)
10.18499/2070-9277-2025-28-3-77-84
5. Абаленихина Ю.В., Щулькин А.В., Ананьева П.Д., Мыльников П.Ю., Микрюкова Е.Д., Гончаренко А.В., Котлярова М.С., Якушева Е.Н. Клеточная линия HEK293-OATP1B3 как модель для изучения белка-транспортера OATP1B3 Сборник научных трудов VIII съезда физиологов СНГ, съезда физиологов СНГ, симпозиум «Белки и пептиды»/ 23-28.04.2025. г. Сочи. , М.: Издательство «Медицина–Здоровье», 2025. – 105с С. 3 (год публикации - 2025)
6. Абаленихина Ю.В., Щулькин А.В., Ананьева П.Д., Мыльников П.Ю., Солотнова С.О., Зацаринная Е.А., Якушева Е.Н., Переверзева К.Г., Звягина В.И. , Трансфицированные клеточные линии как инструмент исследования SLC-транспортеров в фармакологии Наука молодых (Eruditio Juvenium), Т. 13, №4. (год публикации - 2025)
7. Абаленихина Ю.В., Щулькин А.В., Ананьева П.Д., Мыльников П.Ю., Солотнова С.О., Зацаринная Е.А. Особенности детекции и валидации метода вестерн-блот для белка OATP1B3 в трансфицированных клетках HEK293-SLCO1B3 Сборник тезисов "Инновационные технологии в медицине: взгляд молодого специалиста", сборник (год публикации - 2025)