КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер проекта 25-25-01166
НазваниеРазработка клеточных моделей in vitro для изучения заболеваний печени и кишечника
Руководитель Котляров Станислав Николаевич, д-р мед. наук
Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова" Министерства здравоохранения Российской Федерации , Рязанская обл
Конкурс №118 - Конкурс на получение грантов РНФ по мероприятию «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами» приоритетного направления деятельности Российского научного фонда «Поддержка проведения научных исследований и развития научных коллективов, занимающих лидирующие позиции в определенных областях науки»
Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-101 - Экспериментальная медицина
Ключевые слова неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП); неалкогольный стеатогепатит (НАСГ); лекарственно-индуцированное повреждение печени; воспалительные заболевания кишечника (ВЗК); клеточная линия HepG2; клеточная линия Caco-2; ко-культура клеток; барьерная функция кишечника; провоспалительные цитокины; метаболизм липидов; окислительный стресс; метаболизм лекарственных препаратов; in vitro модель; персонализированная медицина
Код ГРНТИ76.03.31
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Цель проекта: Создать и охарактеризовать комплекс in vitro моделей на основе клеточных линий человека (HepG2 и Caco-2) для изучения гастроэнтерологических заболеваний – НАЖБП/НАСГ, токсико-лекарственных поражений печени/ЖКТ и воспалительных заболеваний кишечника.
Проект предусматривает как классические монослойные 2D-культуры, так и продвинутые системы совместного культивирования (ко-культуры) клеток, имитирующие взаимодействие органов (например, «кишечник–печень») и иммунных клеток.
На созданных моделях будут исследованы ключевые биохимические процессы и пути метаболизма, связанные с патогенезом указанных заболеваний, а также оценены эффекты фармакологических соединений для подтверждения функционального применения моделей для дальнейшего тестирования ЛП. Проект ориентирован на выявление новых мишеней для терапии в рамках стратегии персонализированной и превентивной медицины.
Научная новизна.
Будут разработаны интегрированные клеточные модели, позволяющие одновременно изучать барьерную функцию кишечника, метаболизм печени и иммунные реакции в контексте патологий.
В рамках фундаментального исследования планируется ко-культивирование кишечного эпителия (Caco-2) и гепатоцитов (HepG2) с общим питательным контуром для моделирования оси «кишечник–печень». Это позволит изучить влияние микробиотических метаболитов и кишечных факторов на развитие стеатоза и воспаления в печени (например, влияние бутирата на липидный обмен гепатоцитов через укрепление кишечного барьера).
Кроме того, исследование будет включать изучение путей влияния иммунных компонентов, например стимулирование эпителиальных клеток провоспалительными цитокинами (TNF-α, IL-1β) или бактериальными липополисахаридами (ЛПС или LPS) для активации Toll-путей, а также совместное культивирование с макрофагами (или лимфоцитами) для имитации воспалительного микроклиматa. Такой многофакторный подход воспроизведет элементы врожденного иммунитета (например, активацию кишечных макрофагов) и адаптивного ответа, характерные для воспалительных заболеваний кишечникв (ВЗК) и неалкогольного стеатогепатита (НАСГ). Ожидается получение новых данных о вовлеченности путей липогенеза, окислительного стресса, цитокиновых каскадов и детоксикации ксенобиотиков в патогенезе моделируемых заболеваний.
Методология.
В проекте будут применены методы клеточной биологии, биохимии и фармакологии:
- культивирование клеточных линий HepG2 и Caco-2 в 2D-монослое;
- индуцирование моделируемых состояний (стеатоз в HepG2 чрез добавление свободных жирных кислот; повреждение кишечного эпителия Caco-2 путем воздействия цитокинов/LPS; токсическое повреждение печени с помощью известных гепатотоксинов (например ацетаминофена));
- ко-культура Caco-2 и HepG2 на трансвелах с полупроницаемой мембраной (модель «кишечник–печень»), а также ко-культура с иммунными клетками (дифференцированные из моноцитов макрофаги линии THP-1 или периферические мононуклеары).
Ожидаемые результаты.
В ходе проекта будут получены in vitro модели, воспроизводящие ключевые черты перечисленных заболеваний. На этих моделях будут выявлены и охарактеризованы изменения в метаболических и сигнальных путях (липидный обмен, окислительный стресс, цитокиновая активация, активация Toll-like рецепторов).
Результаты позволят установить биохимические маркеры и «мишени» для коррекции патологических процессов; показано влияние жирных кислот на индукцию окислительного стресса и гибели клеток в гепатоцитах. В итоге проект даст новую информацию о патогенезе НАЖБП/НАСГ, ВЗК и лекарственных поражений на клеточном уровне, а также создаст тест-платформу для скрининга новых лекарственных средств.
Научная значимость результатов обусловлена приближением in vitro моделей к физиологическим условиям человека, что повысит трансляционную ценность полученных данных.
Ожидаемые результаты
По завершении проекта ожидается получить ряд новых фундаментальных знаний и методических разработок.
1. Разработанные клеточные модели патологий.
Будут созданы воспроизводимые модели in vitro ключевых гастроэнтерологических заболеваний. В частности, модель стеатоза печени на клетках HepG2, имитирующая НАЖБП/НАСГ, и модель воспаленного кишечного эпителия на клетках Caco-2 для имитации ВЗК. Будет подтверждено, что HepG2 при воздействии смеси свободных жирных кислот (олеиновой и пальмитиновой) накапливают липиды и инициируют стрессовые реакции (повышение перекисного окисления липидов, снижение уровня глутатиона, активация провоспалительных цитокинов) (эти признаки соответствуют патогенезу НАСГ) (9).
Аналогично, на монослое Caco-2 будет продемонстрировано снижение сопротивления и целостности барьера под действием провоспалительных стимулов (TNF-α, LPS) и повышение продукции цитокинов IL-6, IL-8, что воспроизводит картину острого воспаления при ВЗК.
2. Интегрированные ко-культуры и их эффекты.
Впервые РФ в лабораторных условиях будет налажена система одновременного культивирования энтероцитов и гепатоцитов, моделирующая синхронизацию процессов, проходящих в кишечнике и печени. Ожидается показать, что наличие кишечного эпителия (Caco-2) способно модифицировать ответы гепатоцитов на токсическое воздействие. Например, добавление бутирата в среду со стороны кишечных клеток приведет к укреплению барьера (рост TEER) и снижению поступления эндотоксина (LPS) к гепатоцитам, что в результате уменьшит степень стеатоза и воспаления в HepG2 по сравнению с моно-культурой HepG2 (10). Тем самым будет доказана концепция оси «кишечник–печень» in vitro и ее влияние на развитие НАЖБП.
Кроме того, ко-культивирование с иммунными клетками (например, с макрофагами) покажет усиление воспалительных реакций. Ожидается рост секреции TNF-α, IL-8 и повреждение барьерной функции в присутствии активированных макрофагов по сравнению с изолированным эпителием. Данный результат подтвердит роль врожденного иммунитета в патогенезе и продемонстрирует возможность моделирования иммунного компонента in vitro.
3. Выявленные мишени и пути патогенеза.
Биохимический анализ моделей позволит идентифицировать ряд изменений, представляющих интерес как потенциальные мишени для терапии. Например, в модели HepG2-стеатоза мы ожидаем выявить активацию пути NF-κB и повышенную экспрессию цитокинов (IL-1β, IL-8), указывающие на переход от простого стеатоза к воспалению (начало стеатогепатита).
В клетках Caco-2 при воспалении, вероятно, выявится активация каскада MyD88/NF-κB через Toll-подобные рецепторы (TLR4 при воздействии LPS) с повышением синтеза провоспалительных медиаторов.
Также особое внимание будет уделено окислительно-восстановительным процессам, таким как понижение уровня восстановленного глутатиона и активация антиоксидантного ответа (Nrf2) в гепатоцитах при липотоксичности. Повышение продукции NO и активных форм кислорода в кишечном эпителии при воспалении.
Новизной будет изучение малоизученных маркеров, например регуляция Annexin A2 в условиях стеатоза (предварительные данные указывают, что ANXA2 может участвовать в прогрессировании НАЖБП (9), что будет проверено в нашем проекте). Все эти данные расширят понимание молекулярной патофизиологии соответствующих заболеваний.
На основе полученных результатов будут сформулированы предложения по применимости разработанных in vitro моделей в фармакологических исследованиях. Например, мы продемонстрируем, что измерение TEER и уровня провоспалительных цитокинов в ко-культуре Caco-2/макрофагов может служить скрининг-тестом для противовоспалительных средств при ВЗК (подтверждением послужит факт, что действие ЛП в нашей модели приводит к улучшению показателей барьера и снижению цитокинов. (Эффективность будет определяться по TEER и изменению уровня IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α).) (11).
Аналогично, модель HepG2-стеатоза будет использована для тестирования ЛП, и будут даны рекомендации по наиболее информативным критериям оценки (накопление нейтрального жира, активность АЛТ/АСТ in vitro или др.) для раннего скрининга ЛП.
Такие результаты и рекомендации имеют высокую значимость, так как соответствуют мировому уровню исследований и потребностям разработки лекарственных препаратов. Проект, тем самым, внесет вклад в переход к персонализированной и предиктивной медицине, так как предложенные модели могут быть в дальнейшем адаптированы под конкретных пациентов для подбора оптимальной терапии, а пока они послужат удобным фундаментальным инструментом для испытания новых молекул – кандидатов лекарственных препаратов.
Общественная и экономическая значимость.
Результаты проекта имеют большую прикладную перспективу. Разработанные клеточные тест-системы позволят сократить использование животных в доклинических исследованиях, следуя принципам 3R и этическим нормам (3R — replacement — замена (переход от исследований на животных к методам, не использующим живых существ); reduction — сокращение (выполнение как можно меньшего количества исследований на животных); refinement — усовершенствование (сведение к минимуму стресса для животных).
Более точные in vitro модели повысит эффективность отбора кандидатов на ранних этапах разработки лекарственных препаратов, что экономически выгодно для фармацевтической отрасли (снижение затрат на неуспешные клинические испытания из-за поздно выявленной токсичности или неэффективности). Обнаруженные в рамках проекта биомаркеры (например, специфические цитокины, продукты окисления) могут лечь в основу новых диагностических тестов или критериев мониторинга течения НАЖБП и ВЗК. Кроме того, результаты о воздействии метаболитов микробиоты (бутирата и др.) на эпителиальный барьер имеют социальную значимость, так как подкрепляют научно доказательную базу для применения пробиотиков и пребиотиков в профилактике и лечении заболеваний кишечника. В перспективе, разработанные технологии могут быть интегрированы в создание высокотехнологичных систем орган-на-чипе (organ-on-chip) для персонализированного тестирования – тем самым, проект напрямую соответствует приоритетам развития здравоохранения РФ, направленным на высокотехнологичное здоровьесбережение. Ожидается, что полученные результаты будут соответствовать мировому уровню исследований: планируется публикация не менее 4 статей в международных научных журналах, а также доклады на профильных конференциях (по клеточной биологии, гастроэнтерологии). Практическое использование результатов возможно в медико-биологических исследованиях и в фармацевтической отрасли, что при должной проработке может привести к созданию новой или улучшенной продукции – например, стандартных наборов для скрининга гепатотоксичности или проницаемости кишечного барьера in vitro, услуг по персонализированному подбору препаратов (в будущем) и т.д. Таким образом, результаты проекта будут иметь значимость не только для науки, но и для общества (через улучшение подходов к лечению болезней печени и кишечника, повышение качества здравоохранения).