Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Цель исследования – выбор эпитопов из консервативных зон антигенов вируса гепатита С (ВГС) для последующей оценки возможности использования их в разработке пангенотипической вакцины от гепатита С. Выбор консервативных линейных В-клеточных эпитопов, локализованных в основных антигенах вируса гепатита С (ВГС): E1, E2, core, NS3, NS4A, NS4B, NS5A - был сделан на основании литературных данных. При выборе эпитопов из оболочечных белков Е1 и Е2 предпочтение было отдано детерминантам, которые входят в участки взаимодействия с рецепторами и корецепторами и на которые формируются вируснейтрализующие антитела (ВНА). Также включены были два эпитопа из первого гипервариабельного региона (HVR1), сиквенс которых соответствует консенсусной последовательности этого региона. Выбор этих пептидов объясняется тем, что HVR1 имеет два В-клеточных эпитопа и характеризуется высокой изменчивостью аминокислотной последовательности, что позволяет ВГС ускользать от антител. Поскольку консенсусная последовательность построена с учетом многих вариантов, антитела на нее могут взаимодействовать с многими вариантами вируса. Всего было выбрано 9 эпитопов: Е1: 244–260, Е1: 313–327, E1-Е2: 381–393, Е2: 395–411, Е2: 412–422, Е2: 434–446, Е2: 484–499, Е2: 524–535, Е2: 554–569. В антигене core (С-антиген) выявлены четыре консервативных В-клеточных эпитопов (C: 1–17, C: 19–34, C: 34–49, 73–83) и один генотип-специфический, использованный для сравнения (C: 63–75). Антитела к антигену core могут обнаруживаться в течение нескольких десятилетий после полной элиминации вируса, и этим объясняется внимание к этим эпитопам. В неструктурных антигенах (NS) ВГС выявлено 6 линейных консервативных В-клеточных эпитопов: NS3: 1371–1382, NS4A: 1689–1711, NS4B: 1722-1739. NS4B: 1924-1941, NS5A: 2251–2260, NS5A: 2251–2260, NS5A: 2281–2294. Выбранные эпитопные последовательности были синтезированы и получены как пептиды с чистотой более 95%. Для синтеза использовали Fmoc-защищенные L-аминокислоты и смолу Ванга с Fmoc-защитой аминогруппы. Синтезированные пептиды были использованы для выявления В-клеточных эпитопов, ассоциированных с элиминаицей вируса после терапии. Для этого использовали сыворотки крови 100 пациентов с хроническим гепатитом С, завершивших терапию препаратами прямого противовирусного действия неуспешно (50 участников, обозначенных NR) или успешно (50 участников, обозначенных R). Данное исследование было одобрено Этическим комитетом ГБУЗ г. Москва «ИКБ №1» (Протокол №14 от 06.10.2025г.) и Комитетом по биомедицинской этике ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» (Протокол № 109 от 20.10.2025г.). Общепринятым критерием успешного исхода терапии является достижение устойчивого вирусологического ответа (УВО), при котором в сыворотке крови в конце 3-го месяца после лечения не обнаруживается РНК ВГС методом ОТ-ПЦР с чувствительностью не более 15 МЕ/мл. Выявление антител в сыворотках крови пациентов к синтезированным пептидам выполняли методом иммуноферментного анализа (ИФА). Пептиды сорбировали в планшеты с максимальной сорбционной емкостью (СовТех, Россия) в концентрации 20 мкг/мл в 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9.5). Далее выполняли стандартную процедуру ИФА. Сравнение частот обнаружения антител перед началом терапии к пептидам в двух группах пациентов позволило выявить различия в частоте обнаружения антител к пептиду Е2: 434-446 (p=0,0001) и E2: 524-535 (p=0,0440). Для расчета достоверности различий и силы связи применяли метод Фишена, Пирсона и Чупрунова. Значение ОШ (95% ДИ) для пептида Е2: 434-446 составило 6,655 [2,516 – 17,601], а для пептида E2: 524-535 – 2,279 [1,016 – 5,109]. Критерий оценки силы связи по Чупрунову для пептида Е2: 434-446 составил 0,4041, что расценивается как относительно сильная, а для пептида E2: 524-535 – 0,2015, что расценивается как средняя. Известно, что пептид Е2: 434-446 воспроизводил консервативный иммунодоминантный линейный В-эпитоп, антитела на который участвуют в спонтанном клиренсе вируса при острой инфекции. Данная область белка E2 участвует во взаимодействии с рецептором CD81. Пептид Е2: 524-535 воспроизводит консервативный иммунодоминантный В-эпитоп, расположенный внутри петли связывания с CD81, который выступает ключевой мишенью для антител, блокирующих проникновение ВГС в гепатоциты. Между группами участников, завершивших терапию успешно (R) и неудачно (NR), не обнаружено достоверных различий по частоте обнаружения антител к пептидам из С- антигена (p>0,05). Но частота встречаемости антител к NS-антигенам между сравниваемыми группами участников (R и NR) имела достоверные различия по антителам к пептидам NS4B: 1722-1739 (p=0,0002) и NS4A: 1689-1711 (p=0,0287). Величина ОШ (95% ДИ) для пептида NS4B: 1722-1739 составила 3,467 [1,521 – 7,905], а для пептида NS4A: 1689-1711 – 6,000 [1,266 – 57,742]. Критерий оценки силы связи по Чупрунову для пептида NS4B: 1722-1739 составил 0,3005, что расценивается как средняя и для пептида NS4A: 1689-1711 – 0,4127, что расценивается как относительно сильная. Для оценки иммуногенности пептидов были использованы линейные мыши Balb/c, которых иммунизировали пептидами Е2: 434-446, E2: 524-535I, NS4A: 1689-1711 и NS4B:1924-1941 (антитела к которым достоверно чаще определялись в группе пациентов, успешно завершивших терапию) и еще двумя пептидами С: 1-17 и E2: 412-422 (антитела на которые не имели ассоциации с элиминацией вируса). Последние два пептида были выбраны потому, что пептид Е2: 412-422 воспроизводил область, которая взаимодействует с рецептором CD81 и на которую формируются ВНА. А пептид С:1-17 воспроизводил область, антитела на которую очень долго (несколько десятилетий) обнаруживаются у людей со спонтанной элиминацией вируса. На проведение этого эксперимента с участием животных было получено одобрение Комитета по биомедицинской этике (Протокол № 107 от 01.10.2025 г.). Пептидные препараты вводили подкожно в количестве 100 мкг на мышь. Использовали два вида приготовления пептидных препаратов: липосомальная форма (пепдиты включены в липосомы) и смесь пептида с неполным адъювантом Фрейнда, что позволило оценить эффект липосомальной формы пепдидов. Оценка В-клеточного иммунного ответа мышей на разные пептидные препараты показала, что при применении липосомальной формы пептидов, титры антител увеличились на несколько разведений (от 2 до 6). Самые высокие титры были получены на пептиды, включенные в липосомы, Е2: 434-446, Е2: 524-535I и NS4B: 1722-1739. Наиболее высокий индекс стимуляции пролиферативной активности был получен при использовании спленоцитов от мышей, иммунизированных пептидами NS4A: 1689-1711 и Е2: 524-535. В заключение отметим, что две области оболочечного белка Е2, а также две области антигенов NS4B и NS4A представляют интерес для конструирования пангенотипической вакцины от гепатита С.