Разработка способа искусственного оживления грены тутового шелкопряда с целью круглогодичного выращивания и получения сырья для производства биоматериалов

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 25-26-00376

НазваниеРазработка способа искусственного оживления грены тутового шелкопряда с целью круглогодичного выращивания и получения сырья для производства биоматериалов

Руководитель Лейнвебер Евдокия Федотовна, Кандидат сельскохозяйственных наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Северо-Кавказский федеральный научный аграрный центр" , Ставропольский край

Конкурс №102 - Конкурс 2025 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки; 06-204 - Животноводство

Ключевые слова способы искусственного оживления грены, искусственный рацион, тутовый шелкопряд (B. Mori), биотехнологии тутового шелкопряда, биоматериалы протеинов шелка, регенеративная медицина,

Код ГРНТИ68.39.45

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Ожидаемые результаты
Разработка способа с применением высоковольтного источника (устройства) для искусственного оживления грены, вместе с реализованной разработкой ИПС, в совокупности составляют платформенное решение для круглогодичного выращивания тутового шелкопряда, которое позволит реализовать весь потенциал современных биотехнологий шелководства в РФ, направленных на получение инновационных биоматериалов, в том числе и для регенеративной медицины и биомедицины. Результатом реализации проекта является возможность планового перехода к дополнительным прикладным исследованиям, которые возможно будет осуществить для создания инновационных технологий и продукции, а именно: 1. Разработка биоматериалов, получаемых из оболочки кокона: фиброина, серицина, композитов фиброина и серицина. 2. Разработка систем экспрессии на основе тутового шелкопряда: транзиентной и стабильной трансформации зародышевой плазмы, для последующего получения широкого спектра рекомбинантных производных. Основной характерной чертой конкурентоспособности проекта является его универсальность, заключающаяся в возможности применения разработанного способа при производстве широкого спектра биоматериалов, в том числе для регенеративной медицины и биомедицины. Сравнительную эффективность различных систем экспрессии, в рамках данной работы возможно частично продемонстрировать, представив данные по выходу конечного продукта. Так, например, при сравнении систем экспрессии рекомбинантного белка в бакуловирусной системе в клетках насекомых (Sf9) и тутового шелкопряда A Usami и соавт. (2011), отмечали, что производство шелкопряда было более эффективным: один тутовый шелкопряд производил примерно в 70 раз больше белка, чем 106 клеток Sf9 в 2 мл культуральной среды [Usami A, Ishiyama S, Enomoto C, Okazaki H, Higuchi K, Ikeda M, et al. Comparison of recombinant protein expression in a baculovirus system in insect cells (Sf9) and silkworm. J Biochem. 2011;149(2):219–227. DOI: 10.1093/jb/mvq138]. В исследовании, представленном S. Minagawa и соавт. (2020), производство рекомбинантного фибриногена (rFib) в трансгенной системе тутового шелкопряда составляло 20 мг на 1 г коконов (масса одного кокона — 28,4 мг) [Minagawa S, Sekiguchi S, Nakaso Y, Igarashi T, Tomita M. Production of a correctly assembled fibrinogen using transgenic silkworms. Transgenic research. 2020;29(3):339–353. DOI: 10.1007/s11248-020-00202-1], а показатель высокоуровневой экспрессии рекомбинантного фибриногена человека с использованием клеток CHO DG44 за счет оптимизации системы экспрессии и условий культивирования составил 1,3 г/л и выше [Hirashima M, Imamura T, Yano K, Kawamura R, Meta A, Tokieda Y, et al. High-level expression and preparation of recombinant human fibrinogen as biopharmaceuticals. J Biochem. 2016;159(2):261–270. DOI: 10.1093/jb/mvv099]. Для рекомбинантного человеческого кислого фактора роста фибробластов при использовании транзиентной системы экспрессии тутового шелкопряда уровни экспрессии оценивались примерно в 600–700 мкг на личинку (вес зрелой личинки находится в диапазоне ~4,3–4,9 г — прим. авторов) [Wu X, Kamei K, Sato H, Sato SI, Takano R, Ichida M, et al. High-level expression of human acidic fibroblast growth factor and basic fibroblast growth factor in silkworm (Bombyx mori L.) using recombinant baculovirus. Protein Expression and Purification. 2001;21(1):192–200. DOI: 10.1006/prep.2000.1358], а в исследованиях по крупномасштабному получению высокостабильного рекомбинантного человеческого кислого фактора роста фибробластов в штамме Escherichia coli, представленных B. Yu и соавт. (2021), конечный выход чистого белка в культуре составил 158,6 ± 6,8 мг/л [Yu B, Sun W, Huang Z, Sun G, Le Li, Gu J, et al. Large-Scale Preparation of Highly Stable Recombinant Human Acidic Fibroblast Growth Factor in Escherichia coli BL21(DE3) plysS Strain. Front Bioeng Biotechnol. 2021;9:641505. DOI: 10.3389/fbioe.2021.641505]. Качественные характеристики биоматериалов, получаемых из оболочки кокона, и сравнительные исследования по отношению к другим биоматериалам как природного, так и искусственного происхождения раскрывают конкурентные преимущества протеинов шелка, получаемых из оболочки кокона. Так, в частности, комплексное тестирование фиброина шелка и керамических каркасов для регенерации костной ткани продемонстрировало, что каркасы на основе SFпоказали уровни экспрессии выше в 2-3 раза, чем керамические каркасы, а также, что то каркас M-RSF нетоксичен для заполнения костных пустот и способствует лучшему заживлению дефектов переломов по сравнению с коммерческими заполнителями костных пустот на основе кальция [Deshpande, R., Shukla, S., Sayyad, R., Salunke, S., Nisal, A., & Venugopalan, P. (2021). Silk fibroin and ceramic scaffolds: Comparative in vitro studies for bone regeneration. Bioengineering & Translational Medicine, 6(3), e10221. doi: 10.1002/btm2.10221, Deshpande, R., Shukla, S., Kale, A., Deshmukh, N., Nisal, A., & Venugopalan, P. (2022). Silk fibroin microparticle scaffold for use in bone void filling: safety and efficacy studies. ACS Biomaterials Science & Engineering, 8(3), 1226-1238. https://doi.org/10.1021/acsbiomaterials.1c01103]. Эффективность полурезорбируемой мембраны на основе фиброина шелка-глицерина на регенерацию кости при дефектах свода черепа кроликов по сравнению с коммерческой коллагеновой мембраной была исследована K. Sukchan и соавт. (2023) [Kim, J. Y., Yang, B. E., Ahn, J. H., Park, S. O., & Shim, H. W. (2014). Comparable efficacy of silk fibroin with the collagen membranes for guided bone regeneration in rat calvarial defects. The Journal of Advanced Prosthodontics, 6(6), 539.https://doi.org/10.4047/jap.2014.6.6.539]. В РФ E. Prokudina и соавт. (2023) представили в комплексную сравнительную оценку физико-механических характеристик и биосовместимости тканеинженерных сосудистых пластырей, в которой было выявлено, что матрицы, полученные из регенерированного фиброина шелка (SF), показали удовлетворительные результаты, сравнимые с таковыми для лоскута полигидроксибутират/валерат/поликапролактоном с включенным фактором роста эндотелия сосудов (PHBV/PCL/VEGF) и коммерческий лоскутом из бычьего ксеноперикарда (XP), а в случае адгезии и активации тромбоцитов превосходили эти пластыри. Фиброин шелка был охарактеризован как материал, обладающий достаточной биологической совместимостью, что позволяет считать изготовленный из него тканеинженерный матрикс перспективным для имплантации в сосудистую стенку [Prokudina, E. S., Senokosova, E. A., Antonova, L. V., Krivkina, E. O., Velikanova, E. A., Akentieva, T. N., ... & Kochergin, N. A. (2023). New tissue-engineered vascular matrix based on regenerated silk fibroin: in vitro study. Современные технологии в медицине, 15(4 (eng)), 41-48. doi: 10.17691/stm2023.15.4.04]. Кроме того, биоматериалы на основе шелка совместимы с большинством методов стерилизации. В сравнении с большинством матриц на основе других полимеров стерилизация посредством автоклавирования или любого теплового метода денатурирует полимерную сетку, однако шелк преодолевает этот недостаток [Bandyopadhyay, A., Chowdhury, S. K., Dey, S., Moses, J. C., & Mandal, B. B. (2019). Silk: a promising biomaterial opening new vistas towards affordable healthcare solutions. Journal of the Indian Institute of Science, 99(3), 445-487. DOI: 10.1007/s41745-019-00114-y].

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
С целью разработки способа искусственного оживления грены (яиц) тутового шелкопряда, посредством снятия (прерывания) диапаузы током высокого напряжения сконструирована лабораторная установка, к которой подсоединяется высоковольтный источник и производится обработка яиц тутового шелкопряда электрическим разрядом. Подготовлены опытные партии грены моновольтинной породы Кавказ-2, полученные после инкубации и выкормки гусениц тутового шелкопряда: 1) на искусственной питательной среде (ИПС) в зимний, ранневесенний, летний и осенний периоды; 2) на свежем листе шелковицы – весенний, весенне-летний период. Количество опытных партий яиц тутового шелкопряда было расширено за счет вовлечения в процесс грены, полученной на свежем листе шелковицы (обработка проводилась 6 партий, вместо 4 запланированных). В ходе исследований учитывали следующие факторы, определяющие параметры обработки электрическим разрядом: напряжение 5 и 10 кВ, при постоянной силе тока 0,2 мА, экспозиция воздействия от 1 до 10 минут; наиболее чувствительный для снятия диапаузы возраст, обрабатываемых яиц тутового шелкопряда (от 1 до 24 часов); температурный режим хранения грены до обработки: при пониженной температуре (22…23 °С), оптимальной (24…25 °С) и повышенной (26…27 °С). При определении оптимальных параметров обработки током высокого напряжения с целью прерывания диапаузы оценивали оживление яиц (грены) тутового шелкопряда, характеризующее выход гусениц из яиц. При определении оптимальных параметров электрического разряда, создаваемого при помощи высоковольтного источника и лабораторной установки при постоянной силе тока 0,2 мА, были отработаны два режима: время обработки от 1 до 10 минут (экспозиция), напряжение 5 кВ и 10 кВ. Лучшие результаты по оживлению (более 92 %) были получены: 1) при воздействии тока напряжением 5 кВ в течение 8 минут – оживление грены составило 93,3 %, в течение 9 минут – 94,5 %; 2) при 10 кВ в течение 3-4 минут – 95,1 и 94,7 %, соответственно. Проведена оценка реакции грены различного возраста (от 1 до 24 часов) на стимулирующее действие тока высокого напряжения. За возраст яиц (грены) тутового шелкопряда было принято время в часах, прошедшее от откладки яиц до обработки током высокого напряжения. Определен оптимальный временной период для снятия диапаузы воздействием на грену электрического (искрового) разряда при выбранных 2-х режимах обработки: высокие результаты оживления (более 90 %) отмечены в партиях яиц тутового шелкопряда 1-2, 11-13 и 21-24 часового возраста. Из выявленных оптимальных временных промежутков, а именно 1-2, 11-13 и 21-24 часа, определен возраст грены для обработки током высокого напряжения – 2, 11 и 24 часа, характеризующийся достаточно высоким выходом гусениц из яиц при применяемых режимах: оживление грены в возрасте 2 часа составило 92,9-93,5 %; в возрасте 11 часов – 91,4-91,7 %; в возрасте 24 часа – 93,9-94,3 %. От режима с применением напряжения 5 кВ в дальнейшем отказались по причине длительности процесса (экспозиция 8-9 минут). Определена отзывчивости грены на искусственное оживление в зависимости от температуры хранения яиц до обработки током высокого напряжения и возраста грены (от 1 до 24 (суточная) часов), проведено исследование 3-х режимов хранения яиц тутового шелкопряда до обработки электрическим разрядом: 1) при пониженной температуре 22…23 °С; 2) при оптимальной температуре 24…25 °С (общепринятый режим), 3) при повышенной температуре 26…27 °С. Относительная влажность воздуха (ОВВ) при хранении поддерживалась на уровне 75-80 %. Лучшие результаты искусственного оживления грены выявлены при хранении до обработки током высокого напряжения при пониженной температуре 22…23 °С. Выход гусениц из яиц (оживление) при пониженной температуре хранения грены до обработки электрическим разрядом: в возрасте 2 часа составило 96,5 %, 11 часов – 94,8 %, 24 часа – 97,4 %. Определена чувствительность диапаузирующей грены различных моновольтинных пород к воздействию током высокого напряжения на породах тутового шелкопряда различных географических групп из генетической коллекции Станции шелководства – филиал ФГБНУ «Северо-Кавказский ФНАЦ» – «Биоколлекции пород тутового шелкопряда»: Белококонная-2 (китайская группа пород), ЛБВ-2 белая (вьетнамская), Враца-38 (болгарская), в сравнении с отечественной селекции – Кавказ-2 (российская). Подтверждена достаточно высокая чувствительность отобранных моновольтинных породы к воздействию электрического разряда (оживление 90,4-98,2 %), что доказывает эффективность и целесообразность применения обработки током высокого напряжения диапаузирующей грены тутового шелкопряда. Выявленные оптимальные параметры воздействия тока высокого напряжения на диапаузирующую грену тутового шелкопряда в дальнейшем послужат основой для разработки способа искусственного оживления. Подготовлена для подачи на регистрацию заявка на патент «Способ искусственного оживления грены тутового шелкопряда и установка для его осуществления», опубликованы 4 научные статьи, 2 из которых – RSCI, «Белый список», переводная версия одной из них индексируется в Scopus, Web of Science, ход выполнения исследований по проекту освещался в сети Интернет. Ссылки на информационные ресурсы в сети Интернет, посвященные проекту: 1. На Станции шелководства – филиал ФГБНУ «Северо-Кавказский ФНАЦ» начата работа по разработке нового способа искусственного оживления грены тутового шелкопряда в рамках выполнения Гранта РНФ. https://fnac.center/news-fnac/na-stantsii-shelkovodstva-filial-fgbnu-severo-kavkazskij-fnac-nachata-rabota-po-razrabotke-novogo-sposoba-iskusstvennogo-ozhivleniya-greny-tutovogo-shelkopryada-v-ramkakh-vypolneniya-granta-rnf/ 2. Сотрудники Станции шелководства приняли участие в 19-й Выставке инновационных проектов молодых ученых Северного Кавказа. https://fnac.center/news-fnac/sotrudniki-stantsii-shelkovodstva-prinyali-uchastie-v-19-j-vystavke-innovatsionnykh-proektov-molodykh-uchenykh-severnogo-kavkaza/ 3. Шелководство и медицина. https://fnac.center/news-fnac/shelkovodstvo-i-medicina/ 4. Участие Станции шелководства в Международной научной конференции «Приоритетные направления повышения эффективности, конкурентоспособности и устойчивости аграрной отрасли». https://fnac.center/news-fnac/uchastie-stantsii-shelkovodstva-v-mezhdunarodnoj-nauchnoj-konferentsii-prioritetnye-napravleniya-povysheniya-effektivnosti-konkurentosposobnosti-i-ustojchivosti-agrarnoj-otrasli/ 5. Завершение I этапа по Гранту РНФ № 25-26-00376 на Станции шелководства – филиал ФГБНУ «Северо-Кавказский ФНАЦ». https://fnac.center/news-fnac/grant-25-26-00376-razrabotka-sposoba-iskusstvennogo-ozhivleniya-greny-tutovogo-shelkopryada-s-tselyu-kruglogodichnogo-vyrashhivaniya-i-polucheniya-syrya-dlya-proizvodstva-biomaterialov/

Публикации

1. Евлагин В.Г., Лейнвебер, Е.Ф., Евлагина Е.Г., Юматов Е.Н. Методы снятия диапаузы грены с целью круглогодичного выращивания тутового шелкопряда (обзор) Приоритетные направления повышения эффективности, конкурентоспособности и устойчивости аграрной отрасли : Материалы международной научной конференции, посвященной 105-летию ТатНИИСх ФИЦ КазНЦ РАН, Казань, 10–11 июля 2025 года. – Санкт-Петербург: ООО Издательский дом "Сциентиа", Сборник трудов конференции. С. 407-410. (год публикации - 2025)
10.32415/scientia_978-5-907902-43-5(407-410)

2. Евлагин В.Г., Евлагина Е. Г., Юматов Е.Н. Состав, свойства белков шелка и их современные направления применения Биотехнология: взгляд в будущее : МАТЕРИАЛЫ XI МЕЖДУНАРОДНОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЙ КОНФЕРЕНЦИИ , Ставрополь, 27 марта 2025 года. – Ставрополь: Ставропольский государственный медицинский университет., Сборник трудов конференции. С. 146-149. (год публикации - 2025)

3. Евлагин В.Г., Евлагина Е.Г., Лейнвебер Е.Ф., Юматов Е.Н. Искусственное оживление грены тутового шелкопряда током высокого напряжения Амурский зоологический журнал (год публикации - 2025)

4. Юматов Е.Н., Евлагина Е.Г., Евлагин В.Г., Лейнвебер Е.Ф., Юматов Э.Е., Товпеко Д.В., Рагузина Д.В. Биомедицинские материалы платформы тутового шелкопряда для регенерации хрящевой ткани Российские нанотехнологии, том 20, № 4. С. 484-508. (год публикации - 2025)
10.56304/S199272232560059X