КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер проекта 25-44-01008
НазваниеИсследование конформационной динамики при распознавании лигандов, активации и передаче сигнала хемокиновыми рецепторами
Руководитель Борщевский Валентин Иванович, Кандидат физико-математических наук, PhD (признаваемый в РФ), д-р физ.-мат. наук
Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)" , г Москва
Конкурс №103 - Конкурс 2025 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований международными научными коллективами» (DST)
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-208 - Молекулярная биология
Ключевые слова Хемокиновый рецептор; рецепторы, сопряжённые с G-белком; спектроскопия ядерного магнитного резонанса; мономолекулярный резонансный перенос энергии Фёрстера; рентгеновская кристаллография, крио-ЭМ; электронный парамагнитный резонанс; белковая динамика
Код ГРНТИ34.17.00
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Ожидаемые результаты
В результате выполнения проекта будут получены всесторонние данные о молекулярных механизмах активации сигнальных комплексов одного из важнейших регуляторов активности иммунной системы - хемокинового рецептора CXCR2 при помощи интегративного подхода с использованием передовых современных методов структурной биологии и спектроскопии, а именно: флуоресцентной микроскопии, спектроскопии ядерного магнитного (ЯМР) и электронного парамагнитного резонансов (ЭПР), рентгеноструктурного анализа и криоэлектронной микроскопии.
Направление проекта, связанное с криоЭМ, сосредоточено главным образом на структурной визуализации тройных комплексов, состоящих из хемокинов (CXCL) с хемокиновым рецептором CXCR2 и мультифункциональными регуляторными белками β-аррестинами, то есть комплексов CXCL-CXCR2-β-аррестин. На основе полученых структурных данных будет проведен анализ молекулярного механизма, управляющего смещённой сигнализацией, что в конечном счете может привести к разработке переспективных лекарств, обладающих смещенным механизмом действия.
Направление проекта, связанное с кристаллографией, будет направлено на идентификацию перспективных лигандов, связывающихся с ортостерическим сайтом CXCR2 и влияющих на его активацию. Основная цель - получение структуры комплекса CXCR2 с выбранным лигандом с высоким разрешением. Успешная реализация проекта создаст структурный базис для последующего виртуального поиска потенциальных лекарственных препаратов, нацеленных на CXCR2.
Направления, описанные выше, обеспечат основу в виде полноразмерных моделей комплексов CXCR2, которые будут дополнены дополнительной структурной и динамической информацией, полученной с помощью методов, описанных далее.
Направление проекта, связанное с ЭПР, будет сосредоточено на выявлении конформационных изменений во внутреклеточной части белка, вызванных различными хемокинами. Эти исследования позволят раскрыть молекулярные механизмы передачи сигнала, которые запускаются при связывании лиганда и приводят к структурной перестройке во внутреклеточной части белка. Такой подход позволит лучше понять структурные основы явлений смещённого сигналинга и аллостерического модулирования работы хемокиновых рецепторов, оба из которых имеют важное значение для фармакологии этих рецепторов.
Направление проекта, связанное с ЯМР-спектроскопией, будет сосредоточено на исследовании конформационной динамики неупорядоченного N-концевого домена CXCR2 как в растворе, так и в условиях, моделирующих мембранное окружение. Также особое внимание будет уделено изучению взаимодействий этого неупорядоченного, но функционально значимого участка с различными лигандами. Эти исследования помогут глубже понять процесс активации CXCR2: его универсальность для разных лигандов и ключевые отличия в механизмах взаимодействия. При успешной экспрессии полноразмерного GPCR в бесклеточной системе будет синтезирован изотопно-меченый белок для дальнейшего анализа методом ЯМР. Дополнительно планируется проведение титрования рецептора лигандом, что позволит оценить возможность изучения взаимодействий рецептор-лиганд с использованием этого метода.
Направление проекта, связанное с флуоресцентной спектроскопией, направлено на изучение изменения подвижности N-конца рецептора на уровне одиночных молекул с помощью экспериментов по Фёрстеровскому переносу энергии между двумя метками на N-конце белка. В случае успеха это позволит исследовать влияние связывания с различными хемокинами и дополнить данные, полученные в ЯМР-исследованиях. Кроме того, использование чувствительных к окружению меток, расположенных на внутренней части рецептора, поможет дополнить картину активации белка, выявленную с помощью ЭПР-спектроскопии.
Помимо основных результатов, проект предполагает достижение ряда сопутствующих целей, которые являются неотъемлемой частью его выполнения. Работы по установлению криоЭМ и кристаллографических структур потребуют разработки методов получения и функциональной характеристики комплексов CXCR2 с различными партнёрами, что, безусловно, найдет применение в исследовании рецепторов, близких к CXCR2, а также при разработке лекарств. В рамках поднаправлений, связанных с флуоресцентной и ЭПР-спектроскопией, будут развиты методы мечения мембранных белков и анализа получаемых данных, что, без сомнения, поспособствует развитию этих и смежных областей. В направлении ЯМР-спектроскопии одной из приоритетных задач станет разработка методик синтеза различных лигандов CXCR2, включая их изотопно-меченые производные, в миллиграммовых количествах. Успешная реализация этого этапа позволит создать универсальный протокол получения хемокинов, который может найти широкое применение как в фундаментальных исследованиях, так и в биотехнологии. Ещё одним важным результатом станет исследование возможности синтеза CXCR2 в бесклеточной системе. В случае успеха эта технология существенно продвинет изучение GPCR, позволяя получать необходимые образцы белка в течение 1-2 дней.
Говоря в целом, с прикладной точки зрения, полученные в работе данные послужат основой для рационального дизайна и разработки новых высокоэффективных лекарственных препаратов, направленных на лечение заболеваний, связанных с нарушением в работе иммунной системы и развитием рака. По этой причине результаты работы будут представлять большой интерес как для медицины и фармакологии, так и для общества в целом.
Результаты, полученные в ходе выполнения работ по проекту, планируется изложить не менее, чем в одиннадцатидесяти публикациях в передовых международных научных журналах, а также в виде докладов на международных конференциях и патентных заявок.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2025 году
{отформатированный текст представлен в файле с дополнительными материалами}
В первый год работы над проектом была была заложена экспериментальная база для будущих исследовании рецепторов семейства GPCR - от получения природных лигандов и выделения доменов рецепторов до формирования набора методов, позволяющих наблюдать за активацией рецепторов. Это создаёт основу для поиска новых лекарственных молекул и глубокого понимания того, как работают эти мембранные рецепторы.
На начальном этапе были получены ключевые белки-лиганды CXCR2 - хемокины, которые выполняют роль «химических маяков» для клеток иммунной системы. Были созданы генетические конструкции и подобраны условия культивирования бактерий так, чтобы получать миллиграммовые количества очищенных белков CxCL1, CxCL2, CxCL3, CxCL7 и CxCL8. Эти белки уже готовы для дальнейших исследований и экспериментов, направленных на понимание того, как рецептор различает большое количество сходных сигналов в организме.
Параллельно были синтезированы N-концевые фрагменты двух рецепторов - CXCR2 и атипичного хемокинового рецептора DARC. Синтез проходил в бесклеточной системе, что позволило быстро получать также изотопно меченые образцы, необходимые для накопления спектров ядерного магнитного резонанса. Анализ показал, что эти участки рецепторов не имеют фиксированной структуры в отсутствие хемокина, а представляют собой гибкие, динамичные фрагменты. Их подвижность объясняет, как один рецептор может взаимодействовать с целой группой разных хемокинов: домен подстраивается под связанный лиганд.
Для отработки методов наблюдения за изменениями структуры рецептора использовали хорошо изученный аденозиновый рецептор A2AAR. В его внутриклеточную часть был введён одиночный аминокислотный маркер, к которому прикреплён специальный флуоресцентный краситель DyeC. При связывании активаторов спектр свечения красителя менялся: интенсивность увеличивалась, а максимум излучения смещался в «красную» область. Эти изменения отражают переход рецептора из неактивного в активное состояние. Антагонисты, наоборот, не вызывали заметных изменений. Таким образом, удалось создать простой способ определить состояние рецептора по одному флуоресцентному сигналу.
Дополнительно изучено действие ионов натрия. Эти ионы известны как природные отрицательные модуляторы активации GPCR. Эксперименты подтвердили, что они уменьшают интенсивность флуоресценции комплекса рецептора с красителем примерно на 15%, что согласуется с моделями аллостерической регуляции: натрий ослабляет реакцию рецептора на сигналы.
Следующий шаг заключался в разработке методов импульсной ЭПР-спектроскопии для измерения расстояний между отдельными точками внутри рецептора. В модельный рецептор A2AAR были введены две метки, расстояние между которыми можно измерить с точностью до нанометров. Было показано, что в нативной мембране значительная часть природных цистеинов недоступна для мечения, что позволяет избежать сложного мутагенеза и работать с максимально естественной последовательностью белка, добавляя только нужные позиции для наблюдения. Метод был успешно опробирован: основное измеренное расстояние между метками составило около 4,8 нм, что соответствует расчётным данным по известным структурам. Это подтверждает возможность «видеть», как рецептор меняет форму при активации.
Целевой рецептор CXCR2 был получен и очищен из клеток насекомых. Его способность связывать один из природных хемокинов — CXCL8 — подтверждена биофизическими измерениями: при взаимодействии наблюдался рост стабильности рецептора. При этом выявлена тенденция к образованию димеров и агрегации, что характерно для многих мембранных белков. Для улучшения выхода и стабильности были разработаны несколько новых вариантов конструкций CXCR2 с различными вспомогательными участками и тагами. Наиболее перспективные конструкции выбраны для дальнейшего использования в методах ЭПР и флуоресценции.
Параллельно начата работа над получением трёхмерной структуры CXCR2 методом рентгеноструктурного анализа. Создана специализированная конструкция рецептора, в которой некоторые гибкие участки заменены стабилизирующим белком, что облегчает образование кристаллов. Экспрессия и подбор условий проводились в клетках насекомых. Для оценки качества экспрессии использована проточная цитометрия, позволившая достичь очень высоких уровней выхода рецептора на поверхность клеток — до 92%, что важно для последующего выделения и кристаллизации.
Финальным элементом стало создание базы потенциальных лекарственных молекул. Были проанализированы данные крупной базы ChEMBL и отобраны соединения, которые, по расчетам молекулярного докинга, лучше всего подходят для связывания в основном («ортостерическом») кармане CXCR2. Отобранные 81 молекула были сгруппированы по структурному сходству в 63 кластера. Эти представители станут основой для лабораторных тестов и оптимизации химических структур — по сути, это «черновой список» будущих кандидатов на разработку.
Таким образом, за первый год проекта построена полноценная экспериментальная платформа для дальнейшей работы: получены натуральные лиганды и ключевые домены рецепторов, создан инструментарий для отслеживания структурных изменений на уровне отдельных атомов, приготовлены конструкции для будущей кристаллизации и выделена группа перспективных малых молекул. В следующем этапе эти наработки позволят перейти от технической подготовки к фундаментальным исследованиям механики активации рецептора и поиску новых терапевтических соединений.