Роль анти-CRISPR механизмов в распространении антибиотико-устойчивых плазмид среди клинических штаммов Klebsiella pneumoniae

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 25-44-02137

НазваниеРоль анти-CRISPR механизмов в распространении антибиотико-устойчивых плазмид среди клинических штаммов Klebsiella pneumoniae

Руководитель Исаев Артём Борисович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования «Сколковский институт науки и технологий» , г Москва

Конкурс №113 - Конкурс 2025 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований международными научными коллективами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-110 - Общая и молекулярная микробиология; вирусология

Ключевые слова Klebsiella pneumoniae, CRISPR-Cas, анти-CRISPR, Acr, Aca, анти-CRISPR ассоциированные белки, устойчивость к антибиотикам, мобильные генетические элементы, горизонтальный перенос генов, плазмиды

Код ГРНТИ34.15.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Мобильные генетические элементы и горизонтальный перенос генов играют ключевую роль в эволюции микробных геномов. Горизонтальный перенос часто связан с распространением клинически значимых признаков у патогенных бактерий, таких как вирулентность и антимикробная резистентность. В то же время репликация мобильных элементов внутри бактерии-хозяина создает большую метаболическую нагрузку и может даже приводить к гибели/лизису клетки. Это обуславливает необходимость развития разнообразных систем защиты от мобильных генетических элементов, среди которых наиболее распространены системы CRISPR-Cas рестрикции-модификации. У Klebsiella pneumoniae и других микроорганизмах CRISPR-Cas системы представляют существенный барьер для горизонтального переноса, в то время как мобильные элементы выработали различные механизмы противодействия CRISPR иммуннитету (анти-CRISPR белки). Недавно нашими коллегами было показано, что клинически значимые штаммы K. pneumoniae линии ST15 сохраняют плазмиды, несущие гены антимикробной резистентности , несмотря на наличие соответствующих таргетирующих спейсеров в системе CRISPR-Cas типа I-E* бактрии-хозяина. Причиной распространения этих штаммов и поддержания АМР плазмид является анти-CRISPR локус, состоящий из трех компонентов: белка AcrIE9.2, белка AcrIE10, сочетающего функции анти-CRISPR и транскрипционного регулятора, и третьего белка с HTH-доменом, функция которого пока не определена. Мы показали, что структура этого локуса крайне высококонсервативна, и он является наиболее распространенным анти-CRISPR генным кластером у энтеробактерий. Данный проект направлен на детальную характеристику уникальных особенностей механизмов анти-CRISPR, связанных с кластером AcrIE9.2/10/HTH. Используя комбинацию биоинформатических, микробиологических, биохимических in vitro и структурно-биологических подходов, мы изучим: 1. как Acr белки совместно ингибируют CRISPR-Cas системы K. pneumoniae и Escherichia coli; 2. как регулируется экспрессия данного локуса на транскрипционном уровне; 3. как бактерии могут реагировать на присутствие анти-CRISPR-кодирующих кластеров (могут ли другие имунные системы, как PARIS подавлять распростарнение плазмид с Acr генами); 4. изучим разнообразие родственных анти-CRISPR локусов, ассоциированных с распространением плазмид несущих гены антимикробной резистентности среди патогенных энтеробактерий; Результаты исследования внесут значительный вклад в понимание молекулярных механизмов взаимодействия бактерий и мобильных генетических элементов, что имеет важное значение для разработки стратегий контроля распространения антимикробной резистентности.

Ожидаемые результаты
Настоящий проект направлен на изучение механизмов ингибирования систем CRISPR-Cas, широко распространенным анти-CRISPR (Acr) генным кластером AcrIE9.2/AcrIE10/HTH, который часто ассоциирован с плазмидами антимикробной резистентности и обладает уникальными функциональными особенностями. Используя модельные системы CRISPR-Cas типа I-E из Klebsiella pneumoniae и Escherichia coli, мы охарактеризуем индивидуальные роли каждого компонента Acr-кластера в ингибировании CRISPR-Cas и регуляции транскрипции. Ключевым направлением будет изучение функциональной синергии между AcrIE9.2 и AcrIE10 - оба этих белка нацелены на одну и ту же субъединицу CRISPR-Cas системы, но при этом неимзенно кодируются вместе, что указывает на новый кооперативный механизм анти-CRISPR активности. Примечательно, что кластер AcrIE9.2/AcrIE10/HTH демонстрирует новый способ регуляции транскрипции. В отличие от классических анти-CRISPR-ассоциированных (Aca) регуляторов, которые содержат HTH-домены (helix-turn-helix), белок AcrIE10 кодирует RHH-домен (ribbon-helix-helix). Этот двухфункциональный белок сочетает Acr-активность с Aca регуляцией транскрипции, связывая уровень экспрессии Acr с количеством CRISPR-Cas белков. Такой динамический механизм обратной связи, вероятно, позволяет балансировать между необходимостью поддержания плазмиды в присутсвтии CRISPR-Cas системы и токсичностью Acr-белков. Мы исследуем, как RHH-опосредованная регуляция влияет на Acr-активность и поддержание плазмид, а также изучим потенциальную регуляторную роль третьего белка кластера несущего HTH домен. Открытие кластера AcrIE9.2/AcrIE10/HTH как наиболее распространенного Acr-локуса у Enterobacteriaceae, а также идентификация RHH-домена как нового типа Acr-ассоциированного регуляторного домена открывают новые возможности для предсказания и характеристики дополнительных Acr и Aca белков. Используя подход "вины по ассоциации" (guilt-by-association), мы проанализируем геномный контекст компонентов этого кластера и проведем поиск RHH-кодирующих белков вблизи известных Acr-локусов. Эта стратегия позволит идентифицировать и экспериментально подтвердить новые белки-кандидаты из групп Acr и Aca, что значительно расширит известное разнообразие анти-CRISPR белков, кодируемых мобильными элементами. Исследование использует междисциплинарную методологию, сочетающую подходы биоинформатики, микробиологии, биохимии и структурной биологии. Расшифровка механизмов распространения антимикробно резистентных плазмид внесет вклад в разработку новых инструментов контроля патогенных штаммов различных видов Enterobacteriaceae.