Разработка генетических технологий для терапии заболеваний, связанных с конденсатопатией

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 25-64-00013

НазваниеРазработка генетических технологий для терапии заболеваний, связанных с конденсатопатией

Руководитель Георгиева София Георгиевна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук , г Москва

Конкурс №106 - Конкурс 2025 года по мероприятию «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по поручениям (указаниям) Президента Российской Федерации» (генетические исследования)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-110 - Общая и молекулярная микробиология; вирусология

Ключевые слова Экспрессия генов, регуляция транскрипции, белковые комплексы, хроматин, транспорт РНК, активаторы транскрипции, MYC, генетические технологии, редактирование генома, моделирование заболеваний, злокачественная трансформация клеток, биомолекулярные конденсаты

Код ГРНТИ62.37.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Работа многих молекулярных систем клетки строится по принципу образования конденсатов, безмембранных образований белков и нуклеиновых кислот, объединенных слабыми мультивалентными взаимодействиями, для реализации какой-либо функции в клетке. Конденсаты с нарушенной функцией (конденсатопатия) часто выявляются при онкологических заболеваниях, где они приводят к неправильной работе генетического аппарата клетки и реализации генетической информации. С образованием патологических нерастворимых конденсатов транспорта РНК связаны заболевания центральной нервной системы, в частности, нарушения развития или нейродегенеративные заболевания. Активно развиваются терапевтические подходы, направленные на элиминацию и инактивацию молекулярных конденсатов, образование которых приводит к возникновению заболевания (конденсатотерапия). Конденсатотерапия считается новым и перспективным направлением в лечении данных заболеваний. Проект направлен на использование генетических технологий для определения механизмов образования патологических конденсатов и создания новых методов терапии онкологических заболеваний и заболеваний нервной системы, основанных на инактивации патологических конденсатов. Работа будет вестись в следующих направлениях: I. Тестирование модифицированных форм эндонуклеазы Cas9 с повышенной специфичностью редактирования для генетических методов терапии. Будет создана система генетического редактирования на базе модифицированной эндонуклеазы Cas9, обладающей повышенной точностью редактирования и высокой активностью в многоклеточных организмах. Система редактирования будет использована для создания метода генетической терапии MYC-содержащих конденсатов. II. Создание генетических методов терапии онкологических заболеваний, провоцируемых MYC-содержащими конденсатами. Работа будет направлена на создание методов терапии, позволяющих инактивировать в клетках опухоли MYC-содержащие конденсаты, включающие изоформу PHF10A, оставив интактной альтернативную изоформу, необходимую для жизнедеятельности клеток. Будут созданы модельные трансгенные мыши с регулируемым уровнем экспрессии двух типов изоформ PHF10, и разработаны генетические методы, направленные на разрушение конденсатов, содержащих изоформу PHF10А. III. Создание модельной системы для выявления генезиса заболеваний развития центральной нервной системы, в основе которых лежит образование патологических конденсатов транспорта мРНК. Будут созданы трансгенные линии D. melanogaster с мутациями в белках транспорта мРНК, связанными с развитием заболеваний человека. Выбор D. melanogaster позволит моделировать заболевания на простом объекте и быстро получать генетически модифицированных животных. Для D. melanogaster хорошо разработаны система анализа нарушений функций нервной системы и методы молекулярного анализа. Будет проведен анализ влияния точечных мутаций на фенотип, поведение и изменения в структурах мозга D. melanogaster и определены молекулярные механизмы образования патологических конденсатов транспорта мРНК. Это позволит выявить новые мутации – маркеры заболеваний человека, создать систему для тестирования терапевтических подходов и разработать методы конденсатотерапии. В результате выполнения проекта будут созданы генетические методы, направленные на терапию заболеваний с помощью разрушения патологических конденсатов. Будет создана система генетического редактирования с повышенной точностью, что делает ее перспективной для широкого использования. Будут созданы модели, позволяющие выявить механизмы возникновения заболеваний и подбирать терапевтические средства. В работе будут широко применяться генетические технологии, включая создание генетических моделей, новой системы генетического редактирования и нового метода генной терапии. Проект направлен на работу в новой современной области биомедицины, основан на большом экспериментальном заделе коллектива, и его результаты будут полностью новыми и оригинальными.

Ожидаемые результаты
-Будет создана новая система генетического редактирования на базе модифицированной эндонуклеазы Cas9, обладающий повышенной точностью и эффективностью при использовании в многоклеточном организме. - Будут созданы модифицированные формы Cas9, слитой с доменами KRAB/MeCP2 или KRAB/Dnmt3, в векторах для константной или индуцируемой экспрессии в клетках млекопитающих.Cas9, слитая с доменами KRAB/MeCP2 или KRAB/Dnmt3 не будет обладать эндонуклеазной активностью, но, благодаря эффективности и специфичности ее взаимодействия, будет оптимальной в использовании для блокировки транскрипции с необходимого промотора и будет использована для подавления экспрессии различных целевых генов. -Будут созданы модельные трансгенные мыши с регулируемым уровнем экспрессии двух типов изоформ PHF10. Это позволит проводить подбор терапии MYC-содержащих конденсатов в клетках опухоли, определять влияние изоформ PHF10 на экспрессию MYC-зависимых генов, определять влияние уровня экспрессии изоформ PHF10 на развитие организма и онкогенез. Данные модели будут также востребованы в изучении механизмов MYC-зависимой злокачественной трансформации клеток и подборов ее терапии. -Будут созданы принципиально новые генетические методы терапии MYC-зависимых опухолей, основанные на элиминации патологических конденсатов, содержащих MYC и изоформу PHF10, активирующую MYC-зависимую транскрипцию. Таким образом будет создан новый подход к терапии MYC-зависимых опухолей. -Будут определены молекулярные механизмы, приводящие к образованию патологических конденсатов, содержащих MYC и изоформу PHF10А и стимулирующих онкогенез. -Будут созданы модельные системы на базе трансгенных плодовых мушек D. melanogaster для выявления генезиса заболеваний центральной нервной системы (невропатии, задержки развития), в основе которых лежит образование патологических конденсатов транспорта мРНК, обусловленное мутациями в компонентах системы транспорта мРНК (факторах GANP/Xmas-2 и DHX9/MLE). -Будут определены молекулярные механизмы, приводящие к нарушению образования и функционирования конденсатов синтеза и транспорта мРНК. Будет определен механизм возникновения заболевания. -Будут выявлены и охарактеризованы новые наследственные мутации – маркеры заболеваний развития центральной нервной системы. Такие маркеры позволяют определить наличие заболевания на раннем этапе развития, что является ключевым условием его эффективной компенсаторной терапии. -Будут созданы стабильные линии клеток D. melanogaster, в которых различные ядерные или цитоплазматические конденсаты будут маркированы с помощью белков, специфичных компонентов данного конденсата, слитых с флуоресцентным белком, что даст возможность изучать структуру и функции различных конденсатов. Такие линии клеток будут широко востребованы исследователями.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
За отчетный период были выполнены все запланированные задачи: созданы генно-инженерные конструкции, необходимые для дальнейшей работы и получен ряд данных по исследованию свойств конденсатов. Созданы конструкции на основе вектора pAct-Cas9 для тестирования влияния различных модификаций эндонуклеазы SpCas9 на способность эффективно и специфично связываться с таргетным участком генома. Предварительные эксперименты показали, что несколько модификаций, в частности, модификация iSniper действительно имеют высокий и специфичный уровень связывания в клетках дрозофилы. Разработана схема получения трансгенных мышей и созданы конструкции для индуцированной специфичной экспрессии изоформ транскрипционного фактора PHF10. Созданы конструкции для генетического редактирования генов DHX9/mle и GANP/xmas-2 у дрозофилы, получены трансгенные линии дрозофилы, несущие attP сайт вместо DHX9/mle или GANP/xmas-2 генов. Созданы конструкции, несущие полноразмерные копии DHX9/mle и GANP/xmas-2 дикого типа и с внесенными мутациями, которые были клонированы в вектор pRepl, содержащий сайт для сайт-специфической интеграции PhiC31. Для исследования влияния мутаций Leng8/SAC3D2, DHX9/MLE, GANP/Xmas-2, PCID2 и компонентов HLB на структуру и функции конденсатов созданы конструкции для экспрессии нормальных и мутантных форм данных белков в клетках дрозофилы. Для изучения функций белка MLE была получена дополнительная конструкция для экспрессии MLE c делецией в хеликазном домене. Созданы конструкции для визуализации конденсатов в клетках дрозофилы: получены линии S2 клеток, стабильно экспрессирующие белки-маркеры цитоплазматических конденсатов (P-body, Stress granules, 60S рибосомы), конденсатов ядерной поры (канала ядерной поры и цитоплазматических фибрилл), конденсатов рецепторов экспорта из ядра, транскрипционных конденсатов. Была выявлена роль изоформ PHF10 в MYC-зависимой транскрипции и их связь с суперэнхансерами. Установлено, что коактиватором MYC-зависимой транскриипции в клетках человека является изоформа PHF10А (другое название PHF10-P), которая вместе с MYC локализуется преимущественно на промоторах генов. PHF10D (другое название PHF10-S) также частично локализуется на промоторах вместе с PHF10А и MYС, но также в большом количестве находится в кодирующих областях генов и в энхансерных областях. PHF10А вместе с MYC, согласно полногеномному анализу мРНК, регулируют гены, повышенный уровень экспрессии которых, повышает онкогенный потенциал клетки. Было исследовано влияния изоформ PHF10 на миграцию клеток, скорость прикрепления к субстрату, распластывание и инвазивные свойства. Показано, что изоформа PHF10А препятствует стадии адгезии и поляризации клетки и способствует их более эффективной и направленной миграции, в то время как D-изоформа улучшает адгезию клеток к субстрату и важна для поляризации клеток. Также мы выявили, что PHF10D необходим для транскрипции генов в дифференцированных нейронах, в то время как MYC и PHF10А вместе являются антогонистами нейрональной дифференцировки. Были исследованы конденсаты, связанные с транспортом мРНК. С использованием линий S2 клеток, позволяющих визуализировать различные ядерные и цитоплазматические конденсаты в клетках дрозофилы. Был исследован механизм взаимодействия комплекса ядерного экспорта мРНК, TREX-2, с конденсатом ядерной поры. Для работы была использована линия S2 клеток содержащая стабильно экспрессируемый белок Ndc1-mCherry. Было показано, что компоненты конденсата ядерной поры Nup153 и TPR участвуют во взаимодействии с TREX-2 и необходимы для экспорта мРНК hsp70 у дрозофилы. При этом, взаимодействие TPR с конденсатом осуществляется через Nup153. Нокдаун Nup153 и TPR оказывает разное влияние на ассоциацию TREX-2 с ядерной порой. Было показано, что субъединицы TREX-2 образуют несколько контактов с Nup153 и TPR. Таким образом, оба белка, Nup153 и TPR, необходимы для ассоциации TREX-2 с ядерной порой. В другой серии экспериментов было изучено, как осуществляется взаимодействие комплекса TREX-2 с конденсатом мРНП частицы. Было показано, что PCID2 содержит район специфичного и неспецифичного взаимодействия с мРНК. На первой стадии происходит неспецифное взаимодействие PCID2 с 3’-концом мРНК, которое далее позволяет произойти специфичному взаимодействию и ассоциации ТREX-2 с конденсатом мРНП. Наши эксперименты также показали, что нокдаун рецептора ядерного экспорта XPO1 (Crm1дрозофилы) вызывает образование аномальных конденсатов мРНК fos и myc в цитоплазме клеток. Чтобы понять природу данных конденсатов была проведена их ко-локализация с маркерами различных цитоплазматических конденсатов. Для этой цели были использованы полученные линии клеток S2, стабильно экспрессирующие маркеры цитоплазматических конденсатов, таких, как маркер P-bodies (был экспрессирован белок-маркер dDcp1), Stress granules (был экспрессирован белок dRin), рибосом (был экспрессирован маркер-белок dRl8). Было показано, что понижения уровня XPO1 в клетке вызывает образование больших патологических агрегатов рибосом, содержащих исследуемую мРНК. Возможно, что в основе нарушения функций ЦНС, связанных с мутациями XPO1/Crm1, лежит именно образование патологических конденсатов рибосом, что будет исследовано на следующем этапе проекта. Ряд патогенных мутаций DHX9/MLE у человека, связанных с нарушением функции нервной системы человека, не затрагивают его хеликазную активность. Поэтому было проведено исследование роли MLE, лишенного хеликазной активности, в активации генов нервной системы. Было показано, что MLE является коактиватором экспрессии ряда генов, важных для формирования и работы нервной системы. При это для активации некоторых из этих генов необходима хеликазная активность MLE, а для активации других она не важна.

Публикации

1. Сошникова Н.В., Байрамова Д.О., Георгиева С.Г. Ремоделирующий хроматин комплекс SWI/SNF – важный регулятор экспрессии генов в норме и при патологии Генетика, Том 61, номер 11, с. 243-253 (год публикации - 2025)
10.7868/S3034510325110242

2. Вдовина Ю.А., Николенко Ю.В., Орлова А.В., Глухова А.А., Куршакова М.М., Фет С.Р., Творогова А.В., Тюрин-Кузьмин П.А., Головнин А.К., Георгиева С.Г., Копытова Д.В. Nup153 and TPR/Megator interact with TREX-2 subunits and are essential for TREX-2-dependent nuclear export of hsp70 mRNA in Drosophila International Journal of Molecular Sciences, Том: 26, Выпуск: 17, Номер статьи: 8595 (год публикации - 2025)
10.3390/ijms26178595

3. Вдовина Ю.А., Георгиева С.Г., Копытова Д.В. Междоменные взаимодействия белка PCID2, одной из субъединиц комплекса ядерного экспорта мРНК TREX-2 у Drosophila melanogaster Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, Том 523, номер 1, с. 446-451 (год публикации - 2025)
10.7868/S3034543X25040111

4. Золин И.А., Григель А.А., Георгиева С.Г., Краснов А.Н., Николенко Ю.В. Хеликазная активность MLE/DHX9 необходима для регуляции экспрессии ряда тканеспецифичных генов хромосомы 4 Drosophila melanogaster Доклады Российской академии наук. Науки о жизни , Том 524, номер 1, с. 570-575 (год публикации - 2025)
10.7868/S3034543X25050134

5. Золин И.А., Григель А.А., Георгиева С.Г., Николенко Ю.В. MLE/DHX9 without helicase activity activates constitutive expression of nuclear receptor genes in Drosophila melanogaster Доклады Российской академии наук. Науки о жизни (год публикации - 2025)
10.1134/S1607672925601180

6. Панкратова Е.В., Порцева Т.Н., Льянова Б.М., Георгиева С.Г., Степченко А.Г. Ген MYCN в клетках нейробластомы человека активируется высоким уровнем экспрессии стресс-индуцибельной изоформы транскрипционного фактора Oct-1 Доклады Российской академии наук. Науки о жизни (год публикации - 2025)

7. Вдовина Ю.А., Георгиева С.Г., Копытова Д.В. Два РНК-связывающих района PCID2, субъединицы комплекса ядерного экспорта мРНК TREX-2, конкурентно взаимодействуют с 3'-некодирующей областью мРНК ras2 Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, Том 523, номер 1, с. 426-430 (год публикации - 2025)
10.7868/S3034543X25040086

8. Соломатина Е.С., Ковалева А.В., Сошникова Н.В., Саидова А.А. Фокальные контакты как мишень для противоопухолевой терапии: от структуры к клиническим перспективам Acta Naturae (год публикации - 2025)