Бактериофаг-содержащие комплексные скаффолды для лечения раневых инфекций

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 25-64-00030

НазваниеБактериофаг-содержащие комплексные скаффолды для лечения раневых инфекций

Руководитель Тикунова Нина Викторовна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук , Новосибирская обл

Конкурс №105 - Конкурс 2025 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по поручениям (указаниям) Президента Российской Федерации» (междисциплинарные проекты)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-209 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Ключевые слова фаготерапия, бактериофаг, раневая инфекция, множественная антибиотикорезистентность, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, гидрогель, иммобилизация биомолекул, наночастицы, 3D-печать, аддитивные технологии, животная модель

Код ГРНТИ34.57.21

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Лечение инфицированных ран по-прежнему остается актуальной проблемой здравоохранения. Чаще всего инфекции регистрируется в ранах, полученных в результате аварий, несчастных случаев, включая ожоги, а также при огнестрельных и минно-взрывных ранениях, диабетической стопе и т.д. При этом может происходить инфицирование смесью патогенов, и все чаще регистрируется присутствие бактерий с множественной антибиотикорезистентностью или даже панрезистентностью. Порой инфекционные агенты проникают в системный кровоток, что приводит к замедлению нормального процесса заживления ран, может вызвать сепсис, что, в свою очередь значительно увеличивает срок лечения пациентов и, следовательно, повышает нагрузку на здравоохранения. Несмотря на наличие внушительного ряда средств для лечения инфицированных ран, низкая селективность антибактериального действия, быстро вырабатывающаяся резистентность инфекционных агентов к применяемым препаратам и многие другие факторы говорят о необходимости продолжать поиск решений данной проблемы. Постоянный рост антибиотикорезистентных инфекций повысил интерес к бактериофаговой (фаговой) терапии благодаря способности фагов убивать бактерии независимо от их резистентности. К преимуществам фаготерапии относятся их высокая селективность действия против патогенов, позволяющая сохранить нормальную микрофлору, отсутствие токсичности и побочных эффектов, а также безопасность для пациентов с ослабленным иммунитетом, детей и пожилых людей. Для эффективного применения фагов в медицинских приложениях их необходимо доставить в область инфицирования, обеспечить контролируемое высвобождение и стабильность фагов. Одним из наиболее перспективных способов стабилизации и хранения фагов является их помещение в гидрогели — нетоксичные полимерные материалы, обладающие трехмерной развитой сетью, при этом их гидрофильность играет важную роль в удержании большого количества воды, что может служить в качестве биосовместимой среды, подходящей для биологических молекул. Гидрогелевая система обеспечивает контролируемое высвобождение лекарств благодаря своим настраиваемым физическим свойствам и биоразлагаемости, что также применимо к доставке биомолекул. Имеется ряд исследований, показавших перспективность гидрогелей для введения в раны ранозаживляющих компонентов. В том числе, опубликованы положительные результаты по использованию гидрогелей для введения фагов. Однако, систематических исследований стабильности фагов в составе гелевых скаффолдов, сохранения их литических свойств в зависимости от типа гидрогеля, состава дополнительных ранозаживляющих веществ, введенных в его состав, от морфологического типа фага и от бактериальной специфичности фага не проводилось. Кроме того, что большинство исследований проводили в системе in vitro, что существенно ограничивает значимость полученных результатов. Широкое разнообразие гидрогелей позволяет создавать структуры, специфичные для пациента, с индивидуальными формами и свойствами, с помощью 3D-печати. Исследований по возможности включения фагов в качестве антибактериального компонента в гелевые скаффолды, сформированные с помощью 3D-печати опубликовано не было. Тем более не известна стабильность фагов и их совместимость с другими возможными компонентами (наночастицами, обезболивающими средствами и антибиотиками) в многослойных 3D–структурах. Проект направлен на разработку новых раневых покрытий для медицины, в частности для лечения инфицированных ран. Будет проведено комплексное исследование совместимости различных композиций гидрогеля с разными типами бактериофагов, отличающихся по морфологии и специфичности к бактериальным агентам, в системах in vitro и in vivo. В результате выполнения проекта будут разработаны способы получения эффективной лекарственной формы на основе гидроколлоидов и бактериофагов, которые будут использованы для местного лечения инфицированных ран.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения проекта будут разработаны способы получения эффективной лекарственных форм на основе биосовместимых гидроколлоидов и бактериофагов, сочетающих антибактериальные, обезболивающие, ранозаживляющие функции, в том числе с использованием технологии 3D-печати гидрогелевых повязок на нетканой и тканной основе, которые будут использованы для местного лечения инфицированных ран, что обеспечит создание новых инструментов терапии. Поскольку систематических комплексных исследований поведения бактериофагов в гелевых скаффолдах не проводилось, а возможность использования фагов в создании многослойных скаффолдов, получаемых с помощью 3D-печати, вообще не изучалась, то большинство запланированных результатов будет несомненно обладать новизной и, скорее всего, будет превосходить современный мировой уровень. Краткое описание запланированных результатов: - Впервые будут получены данные о влияни строения, заряда и вязкости гидрогелевой матрицы на основе гидроколлоидов природного происхождения (альгинат натрия, хитозан, альбумин), в том числе с внедрением оксидных наночастиц, проявляющих антибактериальные свойства (оксид цинка, диоксид титана) на стабильность и высвобождение различных включаемых компонентов (анальгетиков, консервантов, антибиотиков, не менее 2-х в каждой группе активных реагентов) для широкого спектра типов гидрогелевых скаффолдов, содержащих бактериофаги (ИХБФМ СО РАН). - Впервые будут получены данные сравнительного анализа стабильности, сохранения литической активности и динамики выхода бактериофагов различного морфотипа (подо-, сифо- и миовирусов) и различной специфичности (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis) в различных вариантах гидрогелей, содержащих и не содержащих дополнительные ранозаживляющие компоненты, перечисленные выше (ИХБФМ СО РАН). - Впервые будет разработана технология 3D-печати гидрогелевых повязок на нетканой и тканой основе, содержащих фаги и/или фаговые коктейли пролонгированного действия (ИХБФМ СО РАН). - Впервые будут разработаны методики 3D-печати для создания многослойных мультифункциональных гидрогелевых повязок, содержащих бактериофаги и сочетающих в себе обезболивающие, антибактериальные и защитные слои (ИХБФМ СО РАН). - Впервые будут получены данные о стабильности, литической активности и динамики выхода бактериофагов различного морфотипа (подо-, сифо- и миовирусов) и различной специфичности из многослойных гелевых 3D скаффолдов (ИХБФМ СО РАН). - Впервые будет проведено систематическое исследование и сравнительный анализ различных вариантов бактериофаг-содержащих гелевых скаффолдов, включая многослойные 3D-структуры, в экспериментах in vivo на животных моделях инфицированных ран (на мышах и на крысах) (ИХБФМ СО РАН и ИНВХ им. В.К. Гусака). - Впервые будет проведено "Пострегистрационное открытое нерандомизированное исследование эффективности зарегистрированных иммунобиологических препаратов «Пиофаг», «Секстафаг» и «Стафиллококковый фаг» в сочетании с зарегистрированными гидрогелями разного состава производства Биотекфарм" (ИНВХ им. В.К. Гусака). Кроме того, будет проведен многолетний мониторинг микробного пейзажа в отделениях ИНВХ им. В.К. Гусака, оказывающих помощь пациентам с травматическими повреждениями, ранениями, термическими повреждениями (совместно ИХБФМ СО РАН и ИНВХ им. В.К. Гусака). Поскольку проект направлен на разработку новых раневых покрытий для лечения пациентов с инфицированными ранами, то вовлечение в него специалистов из области медицины крайне необходимо. В качестве партнера выбран ФГБУ "Институт неотложной и восстановительной терапии им. В.К. Гусака Минздрава России (ИНВХ ИМ. В.К. ГУСАКА). Специалисты из организации-партнера имеет огромный опыт проведения сложных и уникальных хирургических операций, в том числе и по поводу огнестрельных и минно-взрывных ранений, а также послеоперационное ведение хирургических пациентов. Пациенты находятся в Институте до выздоровления и могут наблюдаться достаточное время. Кроме того, оценить эффективность раневых покрытий для медицинского применения невозможно без проведения исследований на животных. В организации-партнере имеется виварий с возможностью содержания крыс, а у исследователей из ИНВХ им. В.К. Гусака имеется большой опыт моделирования различных вариантов ран и проведения экспериментальных операций на модельных животных. Таким образом, исследования оптимальных композиций бактериофаг-содержащих гелевых скаффолдов в in vivo экспериментах на мышах, запланированные в организации-заявителе, будут дополнены экспериментами на крысах в организации-партнере. Таким образом, только при объединении усилий специалистов по созданию многослойных конструкций на основе гелей и наноматериалов, включая технологию 3D-печати, специалистов- микробиологов, обладающих опытом работы с бактериофагами в экспериментах in vitro, а также опытом применения фагов для фаготерапии, специалистов-экспериментаторов, способных проверить полученные результаты в экспериментах in vivo на лабораторных животных, и высоко классных клиницистов, позволит не только успешно выполнить проект, но и разработать новый тип раневых покрытий и дать рекомендации по их практическому применению в различных клинических группах пациентов с раневыми инфекциями после огнестрельных и минно-взрывных ранений. Очевидно, что результаты выполнения проекта могут быть легко транслированы в гражданское здравоохранение для лечения травм, ожогов, диабетической стопы, пролежней и послеоперационных инфекций. Оценить эффективность раневых покрытий невозможно без проведения исследований на животных.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
1. Разработан и утвержден протокол исследований заживляющего действия гидрогелей, нагруженных фагами/фаговыми коктейлями на лабораторных мышах. 2. На примере 6 фагов разных по морфотипам и хозяйской специфичности (РA22, РА57, РA136, РМ16, РМ135 и КР265) разработаны оптимальные протоколы внедрения фагов в два разных коммерчески доступных гидрогеля – Гелепран (ООО «Биотекфарм») и гидрогель на основе коллагена (ООО «Живой Коллаген»). 3. Получены данные о влиянии pH, вязкости и способа загрузки фагов на стабильность, литическую активность и кинетику высвобождения фагов из коммерчески доступных гидрогелей (Гелепран и коллагеновый гель) на примере 15 различных фагов (SA20 (миовирус), SA67 (миовирус), SA120 (подовирус) - литически активны против Staphylococcus aureus; РA22 (подовирус), РА54 (подовирус), РА57 (миовирус), РA136 (миовирус) против Pseudomonas aeruginosa; RP179 (миоирус), КР192 (подовирус), КР265 (сифовирус) против Klebsiella pneumoniae; РМ16 (подовирус), РМ75 (подовирус), РМ85 (подовирус), РМ135 (сифовирус) против Proteus mirabilis; AciB323 (миовирус) против Acinetobacter baumannii). Эффективность высвобождения фагов из Гелепрана не зависела от способа загрузки. Эффективность высвобождения фагов из коллагенового гидрогеля максимальна при концентрации коллагена 30 %. Все протестированные фаги стабильны в растворе с диапазоном рН от 5.0 до 9.0. При хранении этих фагов в составе гидрогеля при рН 6.0 (моделирует кислую микросреду хронической раны) и рН 7,4, большинство фагов уменьшили титр, однако сохранился терапевтический уровень титра. 4. Исследована стабильность в разных гидрогелях 6 разных фагов (SA20, SA120, Ste229, РA22, РА57, РA136) и 2-х фаговых коктейлей (anti-staph и антисинегнойный). Показано, что хранение в Гелепране привело значительному или полному снижению титра стафилококковых фагов и фага РА22 уже через 1 месяц. При хранении в коллагеновом геле титр фагов несколько уменьшился в течение 3-х мес., оставаясь терапевтическим. На основе этих результатов, выбран гидрогель на основе коллагена. 5. На основе оригинальных высоколитических фагов и гидрогелевой матрицы, представляющей гидролизат коллагена I, II и III типов (производство ООО «Живой Коллаген»), разработаны оптимальные составы гидрогелей с импрегнированным anti-staph фаговым коктейлем и с антисинегнойным коктейлем фагов. 6. С использованием 9 фагов (SA20, SA120, РA22, РА57, РА136, КР265, РМ16, РМ135 и AciB323) и двух фаговых коктейлей (anti-staph и антисинегнойный) определены значения предельных концентраций анальгетиков, консервантов, антибиотиков, не влияющие на активность фагов. Показано, что: (1) Большинство фаговых препаратов сохранили терапевтический титр при хранении в течение 6 мес. с 5% лидокаином, 5% анилокаином, 2% бензоатом натрия, 0.2% сорбатом калия, 0.3% тетрациклином, 0.5% гентамицином и 0.01% мирамистином. (2) Препараты фагов несовместимы с хлоргексидином. Даже в 0.5% растворе хлоргексидина лишь половина фагов сохранили терапевтический титр в течение 3 месяцев. 7. Проведен анализ ранозаживляющего действия коллагеновых гидрогелей, нагруженных фагами SA20, SA120 и Ste229 против стафилококков и фагового коктейля, содержащего эти 3 фага, а также коллагеновых гелей с фагами РА22, РА57 и РА136 против синегнойной палочки (P.aeruginosa) и фагового коктейля, содержащего эти 3 фага, в сравнении с ранозаживляющим действием этих же шести фагов (по отдельности) и двух коктейлей, нанесенных в буфере. Использовали мышиную подкожную модель стафилококковой или синегнойной инфекции и местное применение препаратов. При стафилококковой инфекции ранозаживляющее действие всех вариантов гелей, нагруженных антистафилококковыми фагами или коктейлем, в среднем было выше, чем у аналогичных фагов, нанесенных в PBS. Лучшее ранозаживляющее действие показали гель с коктейлем и гель с фагом SA120. В контрольной группе введение PBS без фагов не привело к заживлению ран. При синегнойной инфекции лучшее ранозаживляющее действие показали все варианты гелей, нагруженных анти-синегнойными фагами и коктейлем, чем те же препараты, введенные в РВS. Гель без фагов также обладал ранозаживляющим действием, хотя оно было меньшим, чем для гелей, нагруженных фагами. 8. Разработаны методики получения оксидных наночастиц (НЧ), а именно – НЧ оксида серебра, химерных НЧ Ag2O/Ag, а также НЧ оксида цинка и диоксида титана. проявляющих антибактериальные свойства. Получены однородные микрокристаллы оксида серебра кубической формы. Найдены оптимальные условия их псевдоморфного превращения в гибридные Ag2O/Ag и металлические НЧ Ag. Установлено, что в процессе разложения ацетата цинка в этиленгликоле при 160°C образуются НЧ ZnO неправильной сферической формы, состоящие из агрегированных НЧ размерами 20-40 нм. При увеличении концентрации ацетата цинка в этиленгликоле в 3 раза средний размер кристаллитов увеличивается от 12,6 нм до 22,2 нм. Полученные НЧ представляют собой однородные полиэдры пирамидальной формы размером около 25 нм. С увеличением длины гликолевой цепи средний размер НЧ ZnO уменьшается. В пропиленгликоле и в бензиловом спирте образуются полиэдры ZnO неправильной формы размером 25–50 нм. Выявлено, что образование ZnO в диолах протекает через промежуточное соединение реакции – слоистый гидроксид цинка, [Zn(OH)2–x(An–)x/n·mH2O]. Найдены оптимальные условия получения диоксида титана гидролизом изопропоксида титана в этиленгликоле. Показано, что при нагревании изопропоксида титана при температуре 160°C в течение 3 ч образуется аморфный продукт, который после прокаливания при 500 °C 2 ч, согласно данным РФА, представляет собой смесь анатаза и рутила. 9. Определена стабильность фагов в присутствии НЧ Ag₂O, ZnO и TiO2. Концентрацию НЧ для взаимодействия с фагами выбирали на основе предварительного анализа их цитотоксичности, которая соответствовала 10 мкг/мл для НЧ Ag₂O, 20 мкг/мл для НЧ ZnO. Так как НЧ TiO2 не обладали цитотоксичностью в диапазоне концентраций 0.1-50 мкг/мл, использовали концентрацию 20 мкг/мл. Показано, что в указанных концентрациях НЧ не оказывают ингибирующего влияния на активность фагов. 10. Совместно с ИНВХ им В.К. Гусака проведено изучение микробного пейзажа в образцах от пациентов с огнестрельными и минно-взрывными ранами. У обследованных пациентов (n>100) доминировали S. aureus, причем все штаммы обладали резистентностью или множественной резистентностью к антибиотикам и отличались по профилю резистентности между собой, что свидетельствует о независимой контаминации ран. Ссылки на ресурсы в Интернете - https://www.sbras.info/articles/nauka-dlya-obschestva/belkovye-gidrogeli-s-bakteriofagami-bystree-i-luchshe-vylechat-rany - https://scientificrussia.ru/articles/belkovye-gidrogeli-s-bakteriofagami-bystree-i-lucse-vylecat-rany - https://mynewton.ru/2025/08/gidrogeli-s-bakteriofagami-ot-instituta-ihbfm-so-ran-otkryvayut-novyj-etap-v-lechenii-ran/

Публикации

1. Жаркова (Мальбахова) И.А, Ушакова Т.А., Морозова В.В., Долина С.П., Тикунова Н.В., Дмитриенко Е.В. Hydrogel scaffolds with immobilized bacteriophages as promising materials for the treatment of antibiotic-resistant wound infections Future of Biomedicine 2025 : IV international scientific conference : abstract book – Vladivostok : Publishing House of the Far Eastern Federal University, Future of Biomedicine 2025 : IV international scientific conference : abstract book – Vladivostok : Publishing House of the Far Eastern Federal University, 2025. – [166 p.] – ISBN 978-5-7444-6012-9. – DOI https://doi.org/10.24866/7444-6012-9. – URL: https://www.dvfu.ru/science/publishing-activities/catalogueof- books-fefu/. – Date of publication : 08.12.2025.– Text : electronic. (год публикации - 2025)

2. С. П. Долина, И. А. Мальбахова, Т. А. Ушакова, В. В. Морозова, Н. В. Тикунова, Е. В. Дмитриенко СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ ГИДРОГЕЛЕЙ НА ОСНОВЕ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ДОСТАВКИ БАКТЕРИОФАГОВ XII Международная конференция молодых ученых: биоинформатиков, биотехнологов, биофизиков, вирусологов, молекулярных биологов и специалистов фундаментальной медицины — 2025 : сб. тез. / АНО «Инновационный центр Кольцово». — Новосибирск : ИПЦ НГУ, 2025., XII Международная конференция молодых ученых: биоинформатиков, биотехнологов, биофизиков, вирусологов, молекулярных биологов и специалистов фундаментальной медицины — 2025 : сб. тез. / АНО «Инновационный центр Кольцово». — Новосибирск : ИПЦ НГУ, 2025. — 776 с (год публикации - 2025)
DOI: 10.25205/978-5-4437-1843-9-73

3. Алаф Л.А., Чечушков А.В., Морозова В.В., Козлова Ю.Н., Ушакова Т.А., Тикунова Н.В. Phage PM16 Therapy Induce Long-Term Protective Immunity Against Proteus mirabilis via Macrophage Priming Preprints.org (www.preprints.org) (год публикации - 2025)
10.20944/preprints202512.1192.v1

4. Якубовский В.И., Мурзина Ю.И., Бабкин И.В., Козлова Ю.Н., Тикунов А.Ю., Бардашева А.В., Жираковская Е.В., Морозова В.В., Тикунова Н.В. Novel Phage StaphC_127 Specific to Both Staphylococcus capitis and Staphylococcus caprae and Representing a New Genus of Staphylococcal Siphoviruses Preprints.org (www.preprints.org) (год публикации - 2025)
https://doi.org/10.20944/preprints202512.1161.v1