КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер проекта 25-66-00009
НазваниеНовые рекомбинантные штаммы и консорциумы споровых бактерий - основа биофунгицидных препаратов для агропромышленности
Руководитель Празднова Евгения Валерьевна, Доктор биологических наук
Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Южный федеральный университет" , Ростовская обл
Конкурс №105 - Конкурс 2025 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по поручениям (указаниям) Президента Российской Федерации» (междисциплинарные проекты)
Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки; 06-104 - Агробиотехнологии
Ключевые слова Paenibacillus, Bacillus, рекомбинантные штаммы, антимикотики, липопептиды, хитиназа, противогрибковые, антагонизм, регуляция экспрессии, гетерологичная экспрессия, биопленки, бактериальные консорциумы
Код ГРНТИ68.37.13
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Грибковые заболевания ежегодно уничтожают до трети продовольственных культур, нанося серьезный экономический ущерб. Заражение грибными токсинами пищевых продуктов и корма для КРС также представляет угрозу продовольственной безопасности. Применение химических фунгицидов в сельском хозяйстве несет ряд серьезных рисков, поэтому все большим спросом пользуются биопрепараты на основе бактерий с фунгицидной активностью. Но природные биофунгициды зачастую все же менее эффективны, чем токсичные химические средства, что затрудняет переход к экологически чистому сельскому хозяйству. Очевидна необходимость в более эффективных препаратах, объединяющих свойства разных природных штаммов.
В данном проекте с применением технологий генной инженерии будут созданы новые штаммы споровых бактерий родов Bacillus и Paenibacillus, а также консорциумы штаммов на их основе, которые смогут стать основой для новых биофунгицидных препаратов. Эти бактерии имеют огромный потенциал в разработке биопрепаратов, однако разные виды обладают разными узкоспецифичными полезными свойствами. Для объединения этих свойств в одном препарате нужны консорциумы бактерий, дополняющих друг друга, и технологии генной инженерии, позволяющие объединять гены синтеза биоактивных веществ в одном геноме.
В отобранные из природных местообитаний бактерии с потенциально полезными свойствами (синтез биоактивных продуктов, нерибосомальных пептидов и поликетидов, ферментов, разрушающих микотоксины и т.д.) будут введены гены хитиназы из близкородственных видов. Объединение разных механизмов фунгицидной активности в одном геноме позволит получить новые высокоэффективные штаммы.
При трансформации планируется в качестве маркеров для селекции клонов использовать ген дигидрофолат редуктазы dfrA и ТА-системы, что позволит отказаться от часто используемых маркеров - генов резистентности к популярным антибиотикам, и повысить безопасность получаемого препарата.
Изменяя геном штаммов, важно не потерять те их свойства, которые делают данную группу бактерий столь ценной для биотехнологии, а именно способность расти в консорциумах, образовывать споры и биопленки. Эти свойства новых рекомбинантных штаммов, а также изменения в регуляции экспрессии ключевых генов, также будут протестированы, как и биобезопасность полученных штаммов. Изучение данных фундаментальных вопросов позволит сформировать новое наукоемкое направление в производстве биопрепаратов, и вывести его на новый уровень.
Коллектив ЮФУ имеет опыт в разработке препаратов для сельскохозяйственных животных и культурных растений. Планируются полевые испытания препаратов в опытном хозяйстве “Недвиговка” (ЮФУ). Коллектив МФТИ имеет опыт по разработке генноинженерных штаммов, в том числе споровых бактерий.
Практическое применение результатов данного проекта возможно в двух основных направлениях: 1 - разработка препаратов для обработки полей и посевного материала с целью снижения уровня грибковых заболеваний среди сельскохозяйственных растений, 2 - обработка кормов для сельскохозяйственных животных для оптимизации хранения и снижения порчи корма и накопления микотоксинов.
Планируется работа с индустриальными партнерами: уже на первом этапе работ будет собрана коллекция фитопатогенных грибов с полей сельскохозяйственных угодий и из образцов кормов для сельскохозяйственных животных, а при поиске перспективных штаммов будут отобраны антагонисты к ним. Разработанные в ходе проекта фунгицидные препараты будут производиться на базе индустриального партнера (ООО “Агрохолод”) и реализовываться через его систему сбыта.
Ожидаемые результаты
Проект направлен на получение новых знаний о влиянии генетического редактирования на культуральные и симбиотические свойства данных бактерий, а также на разработку подходов к генетической инженерии споровых бактерий для препаратов с противогрибковыми свойствами, применяемых в сельском хозяйстве.
В ходе проекта будут получены фундаментальные результаты, позволяющие изменить существующие подходы к разработке рекомбинантных штаммов споровых бактерий. Будет изучена структура взаимодействия регуляторных путей в геноме споровых бактерий и закономерностей ее изменения при генноинженерном вмешательстве.
Впервые будут изучены особенности гетерологичной экспрессии генов хитиназ в споровых бактериях, будут изучены способности рекомбинантных штаммов расти в консорциумах полезных бактерий и образовывать биопленки, создана схема механизмов генетической регуляции синтеза биоактивных веществ, на основе которой может быть создан новый подход в генной инженерии споровых.
Основным практическим результатом станет создание новых штаммов и консорциумов микроорганизмов с противогрибковыми свойствами на основе штаммов споровых бактерий, в частности, бактерий родов Bacillus и Paenibacillus - продуцентов хитиназ, нерибосомальных пептидсинтетаз, поликетидсинтаз. На примере генов хитиназы будет продемонстрирована принципиальная возможность трансформирования штаммов Bacillus с сохранением свойств, необходимых для использования полученных штаммов в сельском хозяйстве, а именно отсутствия патогенности для человека и КРС, биопленкообразующей и спорообразующей активностей.
Будет создана коллекция природных штаммов с целевыми активностями (антигрибковая, ферментативная активности), а также грибов-патогенов растений и продуцентов микотоксинов, наиболее актуальных для сельскохозяйственной промышленности черноземной зоны в настоящее время.
Будут разработаны критерии, позволяющие определить среди различных бациллярных штаммов наиболее подходящие штаммы-реципиенты для генноинженерных конструкций, а также будут разработаны плазмиды, позволяющие трансформировать штаммы Bacillus.
Опытная партия препарата будет протестирована на сельскохозяйственных растениях, будут получены данные о влиянии препарата на модельные объекты, в том числе в условиях реальных сельскохозяйственных угодий.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В ходе выполнения работ по проекту был произведен отбор образцов, а именно почвы и растений пшеницы с признаками заражения, в следующих локациях: Краснодарский край, Ставропольский край, Воронежская область: поля, засеянные пшеницей; Ростовская область: урбаноземы и лесонасаждения; Московская область: лесопарк; Республика Карелия: лесонасаждение; Камчатский край: склон горы.
Из поврежденных частей растений пшеницы (Triticum aestivum) выделяли патогенные микромицеты, принадлежность до рода определяли по морфологии колоний, конидий и конидиеносцев. Сформирована коллекция из 16 штаммов грибов-патогенов, а именно: 10 штаммов Fusarium spp., 5 штаммов Alternaria spp. и 3 штамма Cladosporium spp.
Для трех штаммов Fusarium spp., определена выработка микотоксина дезоксиниваленола: 11,7 мкг/мл для штамма Fus Крыл1, 15,0 мкг/мл для Fus Кроп1 и 169,2 мкг/мл для Fus Т1, что является очень высоким значением в сравнении с приведенными в литературе данными по выработке токсина различными штаммами Fusarium.
Сформирована коллекция природных штаммов с потенциалом для использования в противогрибковых препаратах. В результате совместных экспедиционных работ из почв выделено 219 штаммов споровых бактерий , обладающих антагонистической активностью. Из наиболее активных штаммов было сформировано две коллекции спорообразующих штаммов-антагонистов патогенных микромицетов: 26 штаммов, обладающих универсальной антифунгальной активностью против Fusarium, Cladosporium и Alternaria, и 12 штаммов, обладающих специализированной активностью к одному или двум родам.
Разные механизмы обеспечения антифунгальной активности у микроорганизмов в коллекции расширяют пул возможных антифунгальных генов, доступных для исследования. Проведен анализ главных компонент и на его основе описана корреляция между антагонистической активностью против различных родов патогенных микромицетов. Также была проведена оценка хитиназной активности наиболее сильных спорообразующих штаммов-антагонистов. Показано, что большинство выделенных штаммов продуцируют хитиназы в среду.
Помимо спорообразующих микроорганизмов, сформирована также коллекция из 12 штаммов Pseudomonas, обладающих антагонистической активностью против патогенных микромицетов.
Шесть образцов корма для сельского хозяйства были протестированы на обсемененность микромицетами и содержание микотоксина дезоксиниваленола. Общая обсемененность всех кормов микромицетами была на уровне 10^2 КОЕ/г, однако в двух кормах количество микромицетов было около 10^3 КОЕ/г. Показано, что в двух кормах, содержание дезоксиниваленола составило 20,3 мг/кг и 31,6 мг/кг, что является очень высоким показателем. В них же отмечено значительное количество микромицета Aspergillus flavus, которые были отобраны в коллекцию как продуценты микотоксинов.
В ноябре 2025 года коллектив проекта провел совместные работы с партнерами в лаборатории молекулярной генетики МФТИ, в ходе которой достигнуты важные результаты по развитию систем экспрессии рекомбинантных хитиназ. Подтверждена функциональная экспрессия целевого белка. Методом денатурирующего электрофореза выявлен белковый продукт, соответствующий рекомбинантной хитиназе из гена chi1, в культурах трансформированных бактерий. Это подтверждает корректность дизайна плазмидной конструкции pXylA-chi и функциональность системы экспрессии.
Успешно создана новая рекомбинантная плазмида pXylA-mKate2. Методом Гибсона клонирован ген флуоресцентного белка mKate2 в вектор pXylA-SzHasA под контроль ксилозного промотора. Полученная плазмида может служить диагностическим инструментом для визуализации и мониторирования экспрессии генов в штаммах благодаря флуоресцентным свойствам белка mKate2.
Реконструирована генная сеть регуляции и построена математическая модель, описывающая механизмы регуляции синтеза противогрибковых метаболитов (фенгицинов, сурфактинов, фузарицидинов и хитиназ) у Bacillus subtilis, B. velezensis и Paenibacillus polymyxa. Модель включает 7 ключевых генов-регуляторов (ComA, Spo0A, AbrB, DegU, Fur, DegQ, CcpA) и 4 входных сигнала окружающей среды (кворум-сенсинг, голодание, дефицит железа). Анализ сетевой топологии выявил центральную роль репрессора AbrB как переключателя между ростом и синтезом противогрибковых веществ.
На основе модельных прогнозов предложены четыре класса стратегий повышения выхода целевых метаболитов: физиологическая оптимизация сред (fed-batch, железо-стресс, двухстадийная ферментация), генетические модификации штаммов (нокаут AbrB, гиперактивные мутации DegU), замена регуляторных элементов и разработка мультиштаммовых консорциумов с разделением функций. Модельные прогнозы указывают на возможность увеличения выхода противогрибковых веществ в 3–10 раз.
Полученная модель служит теоретической основой для целенаправленного конструирования высокопродуктивных штаммов-продуцентов на следующих этапах работы.
В ходе выполнения работ в МФТИ созданы функциональные генетические конструкции для задач проекта. Разработана и валидирована челночная плазмида pPxylA_chi, оптимизированная для трансформации бактерий родов Bacillus и Paenibacillus. В плазмиду успешно клонирован ген хитиназы chi1 из Bacillus licheniformis, который кодирует фермент, разрушающий хитин клеточной стенки грибов-фитопатогенов. Функциональность конструкции подтверждена трансформацией модельного штамма B. subtilis 168 и получением стабильных трансформантов с функциональной экспрессией целевого гена.
Определены оптимальные системы экспрессии. Экспериментально отобраны две высокоэффективные промоторные системы: индуцируемый промотор PxylA для контролируемой экспрессии и конститутивный промотор Pjg695, превосходящий стандартные промоторы по активности в несколько раз. Это позволяет гибко регулировать уровень производства рекомбинантной хитиназы в зависимости от задач биотехнологического процесса.
Публикации
1.
Кудрявцева А.А., Березов Р.В., Уткина А.А., Котовская О., Скутель М.А., Трофимова А., Исаев А.Б., Манухов И.В.
BlihIA—A Novel Type I Restriction-Modification System from Bacillus licheniformis Is Sensitive to In Vitro Inhibition by ArdB Antirestriction Protein
International Journal of Molecular Sciences , 26(17), 8674 (год публикации - 2025)
10.3390/ijms26178674
2.
Васильченко Н.Г., Куликов М.П., Бриславский Я.А., Хмелевцова Л.Е., Алешукина А.В., Березинская И.С., Горовцов А.В., Празднова Е.В., Чистяков В.А
In Silico and In Vitro Analysis of Antifungal Compounds of Ten New Bacillus and Paenibacillus Strains
Applied Microbiology , Volume 5 Issue 4 120 (год публикации - 2025)
10.3390/applmicrobiol5040120
3. Механцева К.В., Кудрявцева А.А., Скрипниченко Р.В., Васильченко Н.Г., Празднова Е.В., Манухов И.В. Бактериальные штаммы-продуценты хитиназ против фитопатогенных грибов и насекомых-вредителей Биотехнология (год публикации - 2025)
4. Покусаев Д.С., Гончаров М.С., Кучер А.Д., Оболенинова А.Р., Куликова Д.Б., Мазанко М.С., Празднова Е.В. Выделение и характеристика холодостойких бацилл-антагонистов фитопатогенных грибов рода Fusarium из почв разных регионов России Живые и биокосные системы (год публикации - 2025)