Особенности структурной организации активного и неактивного повтора рибосомальной ДНК в ядрышке клеток человека.

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 25-74-00076

НазваниеОсобенности структурной организации активного и неактивного повтора рибосомальной ДНК в ядрышке клеток человека.

Руководитель Лужин Артем Васильевич, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук , г Москва

Конкурс №110 - Конкурс 2025 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными, приоритетного направления деятельности Российского научного фонда «Поддержка молодых ученых»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые слова рибосомные повторы, рДНК, пространственная организация, ядрышко, ядрышковый стресс, структура ядрышка, транскрипция рДНК, клеточный стресс, ответ на клеточный стресс, ингибирование транскрипции, ДНК-зависимая РНК-полимераза I, 3С, С-методы, иммунопреципитация хроматина

Код ГРНТИ34.15.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Современные методы изучения трехмерной архитектуры генома, такие как Hi-C, революционизируют наше понимание того, как упаковка ДНК в ядре влияет на регуляцию генов и развитие заболеваний. Эти технологии позволяют визуализировать хроматиновые петли, топологически ассоциированные домены (TADs) и пространственные взаимодействия между регуляторными элементами (Nora et al 2017, Rao et al 2014, Dixon et al 2012). Современные работы в области пространственной организации генома демонстрируют, что нарушения в 3D-структуре хроматина часто ассоциированы с онкологическими, нейродегенеративными и аутоиммунными заболеваниями (Kloetgen et al 2020, Hnisz et al 2016, Stein et al 2022). Например, хромосомные транслокации, такие как филадельфийская хромосома при хроническом миелолейкозе, не только меняют генетическую последовательность, но и нарушают пространственные взаимодействия генов, активируя онкогенные пути (Kloetgen et al 2020, Hnisz et al 2016). Несмотря на колоссальный прогресс, достигнутый за минувшее время в понимании трехмерной организации генома, пространственная структура рибосомных генов до сих пор остается практически не изученной. Это связано в первую очередь со сложностью и неудобством её изучения, ведь рибосомные гены представляют собой тандемные повторы, количество которых достигает нескольких сотен в одной клетке {van Sluis, 2019 #8}. Причем все копии повторов гомологичны друг другу практически на 99%. В представленном проекте мы постараемся идентифицировать пространственную организацию рДНК в клетках человека, а также изучить её молекулярные детерминанты. Планируемые в рамках проекта исследования позволят, во-первых, улучшить наше понимание механизмов регуляции транскрипции рибосомных генов и синтеза рРНК, и, во-вторых, по-новому взглянуть на молекулярные механизмы, лежащие в основе развития разных ядрышко-ассоциированных патологических процессов. Список литературы Boulon, S., Westman, B. J., Hutten, S., Boisvert, F. M., & Lamond, A. I. (2010). The nucleolus under stress. Nature Cell Biology, 12(7), 641-646. Dixon, J. R., Selvaraj, S., Yue, F., Kim, A., Li, Y., Shen, Y., ... & Ren, B. (2012). Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature, 485(7398), 376-380. Hnisz, D., Weintraub, A. S., Day, D. S., Valton, A. L., Bak, R. O., Li, C. H., ... & Young, R. A. (2016). Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science, 351(6280), 1454-1458. Kloetgen, A., Thandapani, P., Ntziachristos, P., Ghebrechristos, Y., Nomikou, S., Lazaris, C., ... & Aifantis, I. (2020). Three-dimensional chromatin landscapes in T cell acute lymphoblastic leukemia. Nature Genetics, 52(4), 388-400. Montanaro, L., Treré, D., & Derenzini, M. (2012). Changes in ribosome biogenesis may induce cancer by dysregulating the cell cycle. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease, 1825(1), 101-110. Nora, E. P., Goloborodko, A., Valton, A. L., Gibcus, J. H., Uebersohn, A., Abdennur, N., ... & Bruneau, B. G. (2017). Targeted degradation of CTCF decouples local insulation of chromosome domains from genomic compartmentalization. Cell, 169(5), 930-944. Rao, S. S. P., Huntley, M. H., Durand, N. C., Stamenova, E. K., Bochkov, I. D., Robinson, J. T., ... & Aiden, E. L. (2014). A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell, 159(7), 1665-1680. Stein, A., Corces, V. G., & Rivera, C. M. (2022). 3D chromatin architecture and epigenetic editing in cancer. Nature Reviews Genetics, 23(8), 487-504.

Ожидаемые результаты
Используя комбинацию методов HiChIP, micro-C и C-TALE, мы планируем не просто понять, какие топологические структуры лежат в основе пространственной организации рДНК, но также идентифицировать молекулярные механизмы, определяющие эту организацию. Для этого мы проанализируем, роль классических архитектурных белков хроматина, таких как CTCF, когезин, WAPL и конденсин в организации рДНК. Модулируя структуру рДНК с помощью нокаутов структура-образующих (Rad21, WAPL) мы оценим вклад структуры рДНК в функциональной активности ядрышка, а именно в транскрипции и процессинге рРНК. Данная работа безусловно актуальна с точки зрения фундаментальной науки, так как поможет с одной стороны наконец-то установить пространственную структуру рибосомного повтора, а с другой позволит лучше понять, как связаны между собой различный транскрипционный статус и формирование трехмерной организации. Кроме того, работа будет иметь и перспективное прикладное значение, поскольку ядрышко (в том числе и транскрипционный статус рибосомного повтора) является одним из первых сенсоров клетки в ответ на клеточный стресс, последний в свою очередь может быть вызван в раковых и нормальных клетках различными химиотерапевтическими противоопухолевыми агентами, что позволит в перспективе корректировать химиотерапию и лучше понять механизмы ответа раковых клеток на химиотерапию. В дополнение полученные результаты способствуют стимуляции развития в области таргетной медицины, поскольку на сегодня известно, что ряд нейродегенеративных и онкологических заболеваний связаны с нарушением структуры и транскрипционного статуса рибосомного повтора.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2026 году
Цель первого года реализации проекта заключалась в разработке инструментов для анализа пространственной организации рибосомной ДНК (рДНК) человека и выявлении факторов, определяющих эту архитектуру. Результаты, полученные в отчетном периоде, позволили не только создать новый высокоразрешающий подход для картирования контактов внутри рДНК-повтора, но и выявить элементы его пространственной организации и оценить вклад транскрипционной активности в их формирование. Сравнительный анализ стандартных методов анализа конформации хроматина. Для выбора оптимальной стратегии картирования контактов внутри рДНК-повтора были протестированы три С-метода: полногеномный Hi-C, HiChIP с антителами к фактору UBF, ассоциированному с активной рДНК, и метод C-TALE, основанный на гибридизационном обогащении Hi-C-библиотек с помощью биотинилированных зондов. Все три подхода позволили зарегистрировать пространственные взаимодействия участков рДНК, однако полученные карты характеризовались низкой плотностью информативных контактов и не выявляли типичных для остального генома структур — топологически ассоциированных доменов (ТАДов) и хроматиновых петель. Кроме того, значительные области рДНК оставались недостаточно представленными на картах контактов, что проявлялось в виде так называемых «белых полос». Проведенный анализ показал, что основными ограничениями данных подходов являются низкое покрытие рДНК-контактов в полногеномных библиотеках и неравномерное распределение сайтов рестрикции DpnII. Обогащение библиотек с помощью HiChIP или C-TALE лишь незначительно увеличивало плотность сигнала, не решая фундаментальных проблем разрешения. Эти результаты обосновали необходимость разработки альтернативного подхода для высокоразрешающего анализа пространственной организации рДНК. Разработка и применение Micro-C-TALE. Ключевым достижением отчетного периода стала разработка подхода Micro-C-TALE, сочетающего фрагментацию хроматина микрококковой нуклеазой, характерную для Micro-C с таргетным обогащением контактов по технологии C-TALE. Замена рестриктазы на микрококковую нуклеазу, фрагментирующую ДНК до мононуклеосомного уровня, позволила существенно повысить разрешение карт и улучшить покрытие рДНК-повтора. Применение Micro-C-TALE в клеточных линиях HeLa, HAP-1 и HCT116 впервые выявило элементы пространственной организации рДНК-повтора. Во всех исследованных линиях в кодирующей области была обнаружена доменоподобная область с повышенной частотой внутренних контактов, в то время как в некодирующей области зафиксированы выраженные хроматиновые петли, наиболее ярко проявляющиеся в клетках HAP-1. Таким образом, полученные данные показывают, что повторяющаяся единица рибосомных генов обладает выявляемой структурированной трехмерной организацией. Влияние транскрипции на архитектуру рДНК. Для оценки роли транскрипционной активности в формировании пространственной структуры рДНК были проведены эксперименты с ингибированием РНК-полимеразы I актиномицином Д в клетках HAP-1. Сравнение карт Micro-C-TALE, полученных для контрольных и обработанных клеток, показало, что подавление транскрипции сопровождается увеличением общей плотности контактов как в кодирующей, так и в некодирующей зонах. Более того, в некодирующей области наблюдалась стабилизация ранее выявленной хроматиновой петли: по данным количественного анализа агрегированных пиков (APA) соотношение «сигнал петли/фон» значимо возрастало. Полученные данные указывают на то, что активная транскрипция РНК-полимеразой I может ограничивать формирование или стабилизацию пространственных контактов внутри рДНК-повтора, тогда как подавление транскрипции способствует усилению структурированных взаимодействий. Идентификация белковых факторов, участвующих в организации рДНК. С помощью иммунопреципитации хроматина с последующим секвенированием (ChIP-seq) были получены профили связывания архитектурного белка CTCF и субъединицы когезинового комплекса Rad21 на рДНК-повторе. Выявлено несколько достоверных сайтов связывания обоих белков. Пространственное расположение этих сайтов точно соответствует области предполагаемых оснований хроматиновой петли, обнаруженной с помощью Micro-C-TALE в некодирующей области рДНК. Эти данные указывают на возможное участие CTCF и когезинового комплекса в формировании петлевых взаимодействий внутри рДНК-повтора и согласуются с моделью cohesin-зависимой петлевой экструзии. Влияние транскрипции на ассоциацию когезина с рДНК. Финальный блок исследований был посвящен анализу того, как транскрипционная активность сказывается на занятости рДНК белками CTCF и Rad21. После подавления РНК-полимеразы I актиномицином Д наблюдалось увеличение связывания Rad21 с рДНК, особенно заметное в области основания хроматиновой петли в некодирующей зоне. Этот результат хорошо согласуется с данными Micro-C-TALE о стабилизации петли при ингибировании транскрипции и поддерживает предположение о том, что активная транскрипция может ограничивать эффективную стабилизацию когезин-ассоциированных пространственных контактов. Таким образом, транскрипционное состояние рДНК вероятно является одним из факторов, регулирующих ее пространственную архитектуру. В совокупности полученные в отчетном периоде результаты впервые показывают, что рибосомная ДНК человека обладает выявляемой трехмерной организацией, включающей доменоподобную область в кодирующей части и CTCF/Rad21-зависимые хроматиновые петли в некодирующей области. Разработанный подход Micro-C-TALE обеспечивает необходимое для таких исследований высокое разрешение и полноту покрытия. Установлено, что активная транскрипция РНК-полимеразы I дестабилизирует пространственные контакты, а её подавление способствует усилению ассоциации когезина и стабилизации петлевых взаимодействий. Полученные нами данные свидетельствуют о принципиально новом уровне регуляции рибосомных генов и закладывают основу для дальнейшего изучения функциональной роли трехмерной архитектуры рДНК в норме и при патологии.

Публикации

1. Петрова Н.В., Дериглазов Д.А., Ковина А.П., Лужин А.В., Шендер В. О., Арапиди Г.П., Гавриков А.С., Мишин А.С., Разин С.В., Величко А.К. Treacle-dependent TOPBP1 condensation regulates the nucleolar DNA damage response Nucleic Acid Research (год публикации - 2026)
10.1093/nar/gkag350