Регуляция активности репарации ДНК: ключ к стабильности генома и здоровью человека

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 25-74-30006

НазваниеРегуляция активности репарации ДНК: ключ к стабильности генома и здоровью человека

Руководитель Лаврик Ольга Ивановна, Доктор химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук , Новосибирская обл

Конкурс №107 - Конкурс 2025 года по мероприятию «Проведение исследований научными лабораториями мирового уровня в рамках реализации приоритетов научно-технологического развития Российской Федерации» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые слова репарация ДНК, эксцизионная репарация оснований, эксцизионная репарация нуклеотидов, репаросома, белок-белковые взаимодействия, белок-нуклеиновые взаимодействия, регуляция репарации, РНК-связывающие белки, поли(ADP-рибозил)ирование, нуклеосомы, ингибирование ферментов репарации

Код ГРНТИ34.15.17

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Репарация ДНК является ключевым механизмом, обеспечивающим стабильность генома и долголетие организмов (Soheili-Nezhad S et al, 2024, Trends Genet). Эффективное исправление повреждений в ДНК защищает геном человека от мутагенных повреждений, а снижение репарационной активности приводит к развитию онкологических и нейродегенеративных заболеваний и прогрессивному старению. Проект направлен на установление механизмов регуляции активности систем репарации ДНК, их роли в поддержании стабильности генома с целью поиска оптимальной стратегии предотвращения онкотрансформации, нейродегенерации и создания ингибиторов ферментов репарации как онкопрепаратов. Один из ключевых механизмов регуляции репарации ДНК и других процессов, связанных с ответом на генотоксический стресс и поддержанием стабильности генома, – поли(ADP-рибозил)ирование (PAR-илирование) , катализируемое ферментами семейства PARP, а именно PARP1 и PARP2. С одной стороны, PAR-илирование PARP (авто-PAR-илирование) и белков-мишеней необходимо для эффективного восстановления повреждений ДНК, с другой – их чрезмерная активация на повреждениях ДНК может приводить к воспалению и злокачественному перерождению клеток (Böhi F, Hottiger M, 2024, Biomedicines) или к нейродегенеративным заболеваниям (Mao K, Zhang G, 2022, FEBS J). Изменение уровня экспрессии и активности некоторых ферментов семейства PARP приводят к развитию тяжелых заболеваний человека и, как следствие, к снижению качества и продолжительности жизни (Bai P, 2015, Mol Cell). Активность ядерных ферментов PARP1 и PARP2 в различных клеточных процессах регулируется уровнем повреждений ДНК и белками-партнерами, модулирующими их активность, в том числе РНК-связывающими белками, имеющими неупорядоченные домены. В клетке ДНК упакована в хроматин, и репарация повреждений синхронизирована с процессами ремодуляции хроматина, происходящего при PAR-илировании гистонов и других факторов ремодуляции хроматина. Основной задачей проекта является определение закономерностей формирования и функционирования комплексов репарации на повреждениях ДНК в составе нуклеосомных частиц и регуляции их активности ферментами PARP1/2, их белками-партнерами, в том числе фактором PAR-илирования гистонов (HPF1), а также путем конденсации макромолекул вокруг повреждения. Такая амбициозная задача по реконструкции функциональной «репаросомы» на повреждении ДНК в составе нуклеосомы ставится впервые. В задачи проекта входит исследование интерактома репарации ДНК, взаимного влияния белков разных систем, выявление перекрывающихся или дополняющих функций этих белков в процессах репарации, их связи с репликацией, транскрипцией и трансляцией, а также их вклада в предотвращение старения и выявление возможного влияния связанных с заболеваниями природных мутаций ключевых ферментов репарации на формирование репаросом и регуляцию процесса репарации. Активность систем репарации в раковых клетках необходимо ингибировать для повышения эффективности действия применяемых в онкотерапии ДНК-повреждающих агентов. Поскольку PARP1 и PARP2 регулируют все процессы репарации ДНК, а также репликацию и другие процессы обеспечения стабильности генома, они рассматриваются как универсальные мишени для создания онкотерапевтических препаратов. Этот факт определяет огромную важность понимания механизмов регуляции репарации ДНК с помощью ферментов PARP и PAR-илирования для разработки новых стратегий лечения онкологических и нейродегенеративных заболеваний, основанных на регуляции процессов репарации.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения проекта будут установлены фундаментальные закономерности формирования и функционирования комплексов репарации на поврежденной ДНК в составе нуклеосомы и их регуляции. Будет осуществлена сборка комплекса белков («репаросомы») эксцизионной репарации оснований (BER) на поврежденной ДНК в составе нуклеосомы, установлено влияние PARP1 и PARP2 на активность ферментов BER и процесса в целом в контексте структурной единицы хроматина. Будет определена роль HPF1 в формировании комплекса BER на нуклеосоме и в регуляции активности процесса репарации при взаимодействии этого фактора с PARP1 и PARP2 при различных повреждениях нуклеосомной ДНК и в присутствии полного комплекса ферментов BER (апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза 1 (АРЕ1), ДНК-полимераза β, ДНК-лигаза/XRCC1). Будет проведена реконструкция «репаросомы» с использованием полиморфных вариантов белков BER, ассоциированных с развитием раковых и нейродегенеративных заболеваний человека, что позволит установить влияние этих мутаций на взаимодействие комплекса BER с нуклеосомой. Будет установлен механизм регуляции активности PARP1 и PARP2 РНК-связывающими белками в процессе исправления повреждений ДНК в нуклеосомном контексте, а также в немембранных компартментах, образуемых путем конденсации макромолекул вокруг повреждения. Проведенное комплексное исследование с использованием реконструированных систем, а также линий клеток, нокаутных по одному или по нескольким из исследуемых белков, позволит достичь прогресса в понимании механизма модуляции процесса BER белками-участниками, РНК-связывающими белками и ансамблем PARP1/2-HPF1, а также PAR-гидролизующими ферментами. Будет установлена роль белков XRCC1 и XPA, выполняющих функцию платформы в комплексах эксцизионной репарации оснований и нуклеотидов соответственно, репликативного белка А (RPA), фактора реинициации синтеза ДНК на поврежденных матрицах PrimPol, в регуляции активности PARP1/2 в различных процессах, вовлеченных в общий метаболизм ДНК. Будет определено влияние неканонических структур ДНК, таких как G-квадруплексы, на эти процессы и их регуляцию. Будут определены активности систем репарации ДНК и поли(ADP-рибозил)ирования, уровни повреждений ДНК в норме и при воздействии генотоксических факторов, а также клеточный уровень никотинамидадениндинуклеотида (NAD) и активности NAD-синтезирующих ферментов у организмов с разной продолжительностью жизни и разного возраста, что позволит выявить связь этих процессов с продолжительностью жизни и их вклад в устойчивость генома и предотвращение возрастных патологий. Будут разработаны новые подходы к созданию селективных ингибиторов PARP1/2 путем направленного воздействия на взаимодействие PARP с белками-партнерами, в том числе с HPF1. Возможные белок-белковые контакты, установленные с помощью компьютерного моделирования комплексов PARP1/2 с белками–партнерами и ДНК, будут использованы для поиска низкомолекулярных лигандов, разрушающих эти контакты. Потенциальные соединения-ингибиторы будут протестированы на способность подавлять синтез PAR, катализируемый PARP1 и PARP2, активируемых свободной ДНК и ДНК в составе нуклеосом, в присутствии и в отсутствие HPF1. Будет определено влияние обнаруженных ингибиторов PARP1 и/или PARP2 на синтез PAR в клетках дикого типа и нокаутных по PARP1 и на способность этих клеток восстанавливать поврежденную ДНК, а также на модельные опухоли in vivo. Выявление роли TDP1 и PARP в репарации разрывов ДНК, индуцированных Top1, позволит предложить новые комбинации ингибиторов TDP1 с используемыми в клинике ингибиторами Top1 (топотекан, иринотекан) и PARP в качестве потенциальной комбинированной терапии рака. Будут получены клеточные линии, моделирующие опухоли с приобретенной устойчивостью к топотекану. Будет изучено влияние комбинированной терапии с помощью ингибиторов Тор1, TDP1 и PARP на эти клетки, а также на продолжительность жизни и безрецидивную выживаемость лабораторных животных с модельными опухолями. Полученные в ходе выполнения проекта результаты позволят решить важные проблемы, касающиеся фундаментальных основ регуляции процессов, обеспечивающих стабильность генома, и будут опубликованы в ведущих международных журналах. На основе полученных фундаментальных результатов будут разработаны новые подходы к созданию эффективных препаратов для терапии нарастающего количества онкологических и нейродегенеративных заболеваний, что необходимо для обеспечения здорового долголетия.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Эффективная репарация ДНК в хроматине зависит от ремоделирования его структуры, в том числе за счет PAR-илирования гистонов с участием PARP1, PARP2 и их кофактора HPF1. Автомодификация PARP1/PARP2 на стадии элонгации регулируется XRCC1, ответственным за сборку комплекса BER. Показано, что ингибирующее действие XRCC1 на активность PARP1/PARP2, почти не зависит от наличия однонуклеотидной бреши (gap) в нуклеосоме (NCP) и усиливается в присутствии Polβ. При этом Polβ, в отличие от XRCC1, влияет на профиль модификации коровых гистонов в gap-NCP только ферментом PARP1. Полученные результаты позволяют предположить специфичную для PARP2 роль в BER: связывание с трудно репарируемым интермедиатом и локальную дестабилизацию нуклеосомы в районе повреждения, индуцированную PAR-илированием гистонов. PARP1 как более активный в автомодификации может обеспечивать PAR-зависимое привлечение факторов ремоделирования для глобальной декомпактизации хроматина. Линкерный гистон H1 известен как мишень PAR-илирования и PAR-связывающий белок, вытесняемый из области входа-выхода нуклеосом PAR-зависимым способом, но механизмы этих процессов и влияние Н1 на репарацию ДНК в линкерах не изучены. Показана очень слабая HPF1-независимая модификация гистона Н1 ферментами PARP1 и PARP2. В присутствии HPF1 и NCP с повреждением ДНК в линкере Н1 модифицируется обоими ферментами на уровне, сопоставимом с модификацией коровых гистонов, и подавляет их модификацию. Гистон Н1 связывается с NCP в присутствии PARP1/PARP2 и полностью диссоциирует из комплекса в процессе PAR-илирования, независимо от присутствия HPF1. Полученные результаты указывают на то, что релаксация хроматина, вызванная диссоциацией гистона Н1, обусловлена его взаимодействием с автомодифицированным PARP1/PARP2. На эффективность репарации ДНК в клетке предположительно влияет образование репарационных компартментов, индуцируемое авто-PAR-илированием PARP1 и PARP2 и привлечением к поврежденной ДНК РНК-связывающих белков, например FUS. Показано, что оба фермента, PARP1 и PARP2 способны индуцировать формирование FUS-ДНК-содержащих компартментов, в условиях, когда их PAR-илирование регулируется HPF1. Для процесса lpBER остается не выясненным детальный механизм переключения от синтеза ДНК с вытеснением цепи, катализируемого Polβ, к FEN1-зависимому удалению 5'-флэпа. Показано, что каталитическая активность FEN1 «включается» на ДНК-интермедиатах, содержащих «равновесную область» не менее одного нуклеотида, формируемую Polβ при встраивании в 3'-конец праймера в нике нуклеотида(ов), комплементарного тому же основанию матрицы, что и 5'-концевой нуклеотид(ы) запирающего праймера. FEN1 связывается с комплексом Polβ-ДНК и расщепляет 5'-флэп в моменты паузирования синтеза Polβ. Длина «репарационных заплаток» в процессе lpBER зависит от концентрации dNTP. Кроме Polβ, основной ДНК-полимеразы BER, в этом процессе может участвовать ДНК-полимераза λ (Pol λ), принадлежащая к тому же Х-семейству, что и Polβ. Сравнительный анализ влияния XRCC1, PARP1 и PARP2, а также совместного влияния XRCC1 и PARP1/2 на активность Polβ и Polλ в реакции заполнения бреши в процессе BER показал, что совместные эффекты XRCC1 и PARP1/2 более выражены для Polβ, чем для Polλ. Выявленные различия могут быть одной из причин функционирования в качестве главной ДНК-полимеразы Polβ, а не Polλ. Созданы олигонуклеотиды с теломерным повтором (GGGTTA) и повтором (GGGT), который известен своей способностью формировать G-квадруплекс параллельной топологии. Показано, что RPA связывается с G-квадруплексами параллельной и гибридной топологии, однако расплетает только G-квадруплекс гибридной топологии, соответствующей теломерному повтору, а PARP1 связывается и с параллельными, и с гибридными G-квадруплексами. Для изучения активности ферментов NER долгоживущих (Myotis brandtii) и короткоживущих организмов (Mus musculus, Myotis blythii) in vitro и ex vivo отработана методика синтеза и получены модельные ДНК-субстраты, содержащие синтетические повреждения с флуоресцеинилкарбамоиловым производным, который является аналогом объемного повреждения ДНК, которое опознается и удаляется системой NER. При разработке новых методов лечения заболеваний человека все больше внимания уделяется белкам ферментам репарации ДНК в качестве фармакологических мишеней. Разработаны схемы синтеза и синтезированы соединения класса изоиндолинона потенциальных ингибиторов PARP1 и PARP2. Исследована ингибирующая активность узкобороздочных лигандов (бис- или трис-бензимидазолов) в отношении TDP1, TDP2, PARP1 и PARP2. Наиболее активными оказались димерные соединения групп DB2Py(n) и DB3P(n), которые способны ингибировать TDP1 в субмикромолярном диапазоне концентраций и демонстрируют высокую селективность в отношении TDP1, но практически не оказывают влияние на активность TDP2, PARP1 и PARP2. Получен клон клеток линии А549 2В8 (карцинома легкого человека А549) c нокаутом по гену PARP1. Показано, что нокаут по PARP1 не изменяет морфологию клеток, скорость пролиферации и уровень экспрессии PARP2, но снижает уровень синтеза PAR в ответ на окислительный стресс. Полученную клеточную линию А549 2В8 можно использовать для изучения функций PARP1 в поддержании геномной стабильности в опухолевых клетках. На основе линии клеток A549 создана и охарактеризована клеточная линии с нокаутом по гену TDP1. Обнаружено, что ингибитор TDP1, липофильное производное пуринового нуклеозида, проявляет сенсибилизирующий эффект к действию топотекана в опухолевых клетках (A549) дикого типа и не демонстрирует сенсибилизирующий эффект в неопухолевых клетках (HEK293A). Эти результаты показывают, что липофильные производные нуклеозидов могут рассматриваться как кандидаты для дальнейшей разработки в качестве сенсибилизаторов противоопухолевых препаратов. Получены резистентные к топотекану клеточные линии рака молочной железы MCF7 и колоректального рака НСТ116, которые можно использовать как платформу для поиска противоопухолевых препаратов, позволяющих преодолеть резистентность к ингибиторам Top1.

Публикации

1. Чернышова И.А., Корниенко Т.Е., Дырхеева Н.С., Захаренко А.Л., Чепанова А.А., Орищенко К.Е., Курочкин Н.Н., Дреничев М.С., Лаврик О.И. Validating TDP1 as an Inhibition Target for Lipophilic Nucleoside Derivative in Human Cells International Journal of Molecular Sciencies , V. 26, No. 20, P. 10193 (год публикации - 2025)
10.3390/ijms262010193

2. Лебедева Н.А., Мальцева Е.А., Речкунова Н.И., Лаврик О.И. Regulation of the activity of DNA repair polymerases β and λ by proteins XRCC1, PARP1 and PARP2 Biochemistry (Moscow) (год публикации - 2026)

3. Дырхеева Н.С., Чернышова И.А., Арутюнян А.Ф., Захаренко А.Л., Кутузов М.М., Науменко К.Н., Вензель А.С., Иванисенко В.А., Деев С.М., Жузе А.Л., Лаврик О.И. The effect of dimeric bisbenzimidazoles on the activity of DNA repair enzymes TDP1, TDP2, PARP1 and PARP2 Vavilov Journal of Genetics and Breeding , V. 29, No. 7, P. 1097-1108 (год публикации - 2025)
10.18699/vjgb-25-114