Построение структурной базы для рационального дизайна биологически значимых макромолекул с использованием криоэлектронной микроскопии

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 19-74-20146-П

НазваниеПостроение структурной базы для рационального дизайна биологически значимых макромолекул с использованием криоэлектронной микроскопии

Руководитель Штам Татьяна Александровна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение "Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" , Ленинградская обл

Конкурс №5031 - Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по мероприятию «Проведение исследований на базе существующей научной инфраструктуры мирового уровня» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными (31)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые слова криоэлектронная микроскопия, биоподобные структуры, рациональный дизайн, экзосома, вирусоподобная частица, нуклеопротеин, бета-галактозидаза, глюкоамилаза, мРНК, пептидные препараты

Код ГРНТИ34.17.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
В рамках настоящего проекта планируется использовать метод современной криоэлектронной микроскопии для: 1) исследования морфологии экстраклеточных везикул (ЭВ) и экзосом из различных источников, а также оценки эффективности нагрузки везикул экзогенными молекулами с определением локализации вводимого «груза»; 2) определения пространственного строения рибосомы млекопитающих в комплексах с предполагаемыми ингибиторами биосинтеза белка; 3) изучения структурно-функциональных взаимосвязей термостабильных ферментов с целью улучшения их характеристик путём рационального дизайна на основе структурных данных и результатов молекулярного моделирования. 1) Наноразмерные внеклеточные везикулы и экзосомы, секретируемые клетками организма в среду, изменяют картину межклеточных взаимодействий, развития тканей и органов, рост новообразований и определяют реакцию организма на стрессовые, токсические и лекарственные факторы. В планируемом исследовании, посвященном особенностям структуры и биохимического состава экзосом при различных патологических состояниях, будут предложены новые диагностические технологии, основанные на анализе изменений в составе белков, липидов и/или нуклеиновых кислот, переносимых экзосомами. Кроме того, на основе структурных данных, полученных с помощью криоэлектронной микроскопии, будут определены морфологические особенности внеклеточных везикул при некоторых заболеваниях, включая редкие патологии, для которых такие исследования не проводились ранее. В ходе работ по Проекту 2019 и ранее были успешно апробированы некоторые способы нагрузки и доставки терапевтических белков или молекул siRNA в клетки человека с помошью везикул. Однако в этих исследованиях нам не удалось определить локализацию нагружаемых молекул в составе везикул. Решению вопроса о расположении экзогенного груза при разных техниках нагрузки везикул и планируется посвятить исследования в рамках проекта, используя для визуализации везикул и груза метод криогенной томографии. 2) Трансляционный аппарат млекопитающих является одной из мишеней при разработке противоопухолевых и антивирусных препаратов. В этом исследовании мы планируем определить молекулярный механизм противоопухолевого действия нескольких низкомолекулярных ингибиторов биосинтеза белка из класса квассиноидов и тетрациклинов, предположительной мишенью которых является рибосома. Для решения этой задачи будут проведены следующие работы: тестирование противоопухолевой активности ингибиторов на ряде клеточных линий человека и животных; проверка эффективности препаратов для ингибирования синтеза белка в системе in vitro; выделение и очистка рибосом из клеток млекопитающих, получение структуры рибосом млекопитающих в комплексе с ингибиторами при помощи анализа одиночных частиц (SPA). Внимание будет также уделено и связывающимся с рибосомой белкам. В частности, мы планируем изучить взаимодействие белка G3BP1, ключевого компонента стресс-гранул, с 40S субчастицей рибосомы. 3) Поиск ферментов с новыми свойствами для применения в биотехнологических задачах, особенно среди микроорганизмов с экстремальным ареалом обитания, остается по-прежнему актуальным, как и выяснение природы адаптации белковых молекул к агрессивным условиям среды. В этом направлении будут продолжены исследования высоко термостабильного мультидоменного фермента DaβGal, впервые нами клонированного из гипертермофильной археи D. amylolitus, и представляющего новый класс мультидоменных β-галактозидаз семейства GH35. Получение данных о структуре фермент-субстратного комплекса существенно облегчит проведение рационального дизайна для улучшения каталитических свойств фермента и понимания механизмов его функционирования. Другой задачей является увеличение выхода ферментного продукта. С этой целью планируется создание системы экспрессии и секреции фермента в термотолерантных дрожжах P. pastoris, а также исследовать получаемую в этом случае гликозилированную форму белка.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Мирошникова В.В., Драчева К.В., Камышинский Р.А., Ястремский Е.В., Гараева Л.А., Побожева И.А., Ланда С.Б., Анисимова К.А., Баландов С.Г., Хамид З.М., Василевский Д.И., Пчелина С.Н., Коневега А.Л., Штам Т.А. Cryo-electron microscopy of adipose tissue extracellular vesicles in obesity and type 2 diabetes mellitus PLoS ONE, PLoS ONE 18(2): e0279652 (год публикации - 2023)

2. Гараева Л.А., Комарова Е.Ю., Емельянова С.С., Гужова И.В., Маргулис Б.А., Коневега А.Л., Штам Т.А. РАСТИТЕЛЬНЫЕ ВЕЗИКУЛЫ – ПЕРЕНОСЧИКИ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ЭКЗОГЕННОГО БЕЛКА HSP70 Сборник тезисов 26-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых с международным участием, с.18-19 (год публикации - 2023)

3. А.Д. Изюмченко, А.Э. Копытова, Д.Г. Кулабухова, Л.А. Гараева, И.В. Милюхина, Е.Б. Пичкур, С.Н. Пчелина, Т.А. Штам. Криоэлектронная микроскопия экстраклеточных везикул плазмы крови при болезни Паркинсона, ассоциированной с мутациями в гене GBA1 © НИЦ «Курчатовский институт» – ПИЯФ: Сборник тезисов «X Всероссийского молодежного научного форума с международным участием “Open Science 2023”, Сборник тезисов «X Всероссийского молодежного научного форума с международным участием “Open Science 2023”, 15–17 ноября 2023, г. Гатчина. С. 100. (год публикации - 2023)

4. Сорокин И.И., Пичкур Е.Б., Гараева Л.А., Красота А.Я., Штам Т.А., Дмитриев С.Е. STRUCTURAL AND FUNCTIONAL ASPECTS OF EUKARYOTIC RIBOSOME INHIBITION BY QUASSINOIDS Book of abstracts: RUSSIAN INTERNATIONAL CONFERENCE ON CRYO-ELECTRON MICROSCOPY, Book of abstracts: RUSSIAN INTERNATIONAL CONFERENCE ON CRYO-ELECTRON MICROSCOPY, p.9 (год публикации - 2023)

5. Штам Т.А., Драчева К.В., Камышинский Р.А., Ястремский Е.В., Гараева Л.А., Побожева И.А., Ланда С.Б., Анисимова К.А., Баландов С.Г., Хамид З.М., Василевский Д.И., Пчелина С.Н., Коневега А.Л., Мирошникова В.В. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles of adipose tissue in obesity and type 2 diabetes Book of abstracts: RUSSIAN INTERNATIONAL CONFERENCE ON CRYO-ELECTRON MICROSCOPY, Book of abstracts: RUSSIAN INTERNATIONAL CONFERENCE ON CRYO-ELECTRON MICROSCOPY, p.50 (год публикации - 2023)

6. Е.Д. Путевич, Л.А. Гараева, А.С. Спицына, Е.А. Толстыко, С.С. Емельянова, Л.А. Соломина, Е.Ю. Комарова, И.А. Сизова, Т.А. Штам ЭКСТРАКЛЕТОЧНЫЕ ВЕЗИКУЛЫ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ КАК ПЕРСПЕКТИВНЫЕ ПЕРЕНОСЧИКИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ Образование и наука – стратегическая платформа для будущего Фармации» : сборник тезисов, Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 15-летию создания фармацевтического отделения на факультете фундаментальной медицины МГУ, с.145-147 (год публикации - 2023)

7. Л.А. Гараева, Е.Ю. Комарова, С.С. Емельянова, И.В. Гужова, Б.А. Маргулис, А.Л.Коневега, Т.А. Штам РАСТИТЕЛЬНЫЕ ВЕЗИКУЛЫ – ПЕРЕНОСЧИКИ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ЭКЗОГЕННОГО БЕЛКА HSP70 Образование и наука – стратегическая платформа для будущего Фармации» : сборник тезисов, Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 15-летию создания фармацевтического отделения на факультете фундаментальной медицины МГУ, с. 44-46 (год публикации - 2023)

8. Штам Т.А., Гараева Л.А., Комарова Е.Ю., Емельянова С.С., Путевич Е.Д., Коневега А.Л., Маргулис Б.А., Гужова И.В. Шаперон HSP70 в составе растительных везикул активирует противоопухолевый иммунный ответ в клеточных и животных моделях меланомы и колоректального рака VI Международная конференция ПОСТГЕНОМ’2024 XI Российский симпозиум БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ Российско-китайский конгресс в области наук о жизни (ПСБ «Патриот», 29 октября – 2 ноября 2024). Сборник тезисов докладов. – М.: Издательство «Перо», 2024., VI Международная конференция ПОСТГЕНОМ’2024 XI Российский симпозиум БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ Российско-китайский конгресс в области наук о жизни (ПСБ «Патриот», 29 октября – 2 ноября 2024). Сборник тезисов докладов. – М.: Издательство «Перо», 2024., С. 60 (год публикации - 2024)

9. Путевич Е.Д., Гараева Л.А.-А., Толстыко Е.А., Спицына А.С., Емельянова С.С., Соломина Л.А., Комарова Е.Ю., Сизова И.А., Штам Т.А. Экстраклеточные везикулы микроводорослей как доставщики противоопухолевых препаратов Успехи молекулярной онкологии, том 10 №4 Приложение, МАТЕРИАЛЫ VIII Всероссийской конференции по молекулярной онкологии, МАТЕРИАЛЫ VIII Всероссийской конференции по молекулярной онкологии 20–22 декабря 2023 г., Москва, c. 133 (год публикации - 2023)

10. Копытова А.Э., Усенко Т.С., Силантьев А.С., Лузанова В.Д., Изюмченко А.Д., Кулабухова Д.Г., Гараева Л.А., Милюхина И.В., Пичкур Е.Б., Захаржевская Н.Б., Штам Т.А., Пчелина С.Н. Изменение липидомного профиля и морфологии экстраклеточных везикул плазмы крови при болезни Паркинсона, ассоциированной с мутациями в гене GBA1 Международный Конгресс "VIII Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященный 300-летию российской науки и высшей школы" - Сборник тезисов. Саратов, 2024. , Сборник тезисов: Международный Конгресс "VIII Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященный 300-летию российской науки и высшей школы". Саратов, 2024. С. 578. (год публикации - 2024)

11. Дмитриев С.Е., Пичкур Е.Б., Гараева Л.А., Красота А.Ю., Колосова О., Згадзай Ю., Панова Е.А., Штам Т.А., Юсупов М.М., Коневега А.Л. СТРУКТУРНЫЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ ИНГИБИРОВАНИЯ ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ РИБОСОМЫ КВАССИНОИДАМИ Сборник трудов Курчатовского геномного форума 2024. 21 – 22 октября 2024. / сост.: Патрушев М.В.; Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт». – Москва : НИЦ «Курчатовский институт», 2024. – 393 с., Курчатовский геномный форум 2024, сс. 215-216 (год публикации - 2024)

12. Пичкур Е.Б., Киль Ю.В., Сергеев В.Р., Коневега А.Л., Штам Т.А, Самыгина В.Р., Рычков Г.Н. НОВАЯ ТЕРМОСТАБИЛЬНАЯ БЕТА-ГАЛАКТОЗИДАЗА С УНИКАЛЬНОЙ СЕМИДОМЕННОЙ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРОЙ Сборник трудов Курчатовского геномного форума 2024. 21 – 22 октября 2024. / сост.: Патрушев М.В.; Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт». – Москва : НИЦ «Курчатовский институт», 2024. – 393 с., Курчатовский геномный форум 2024, сс. 241-242 (год публикации - 2024)

13. Гараева Л.А., Комарова Е.Ю., Емельянова С.С., Гужова И.В., Маргулис Б.А., Коневега А.Л., Штам Т.А. Нагруженные экзогенным hsp70 везикулы растительного происхождения способствуют активации противоопухолевого иммунитета на клеточных и животных моделях Успехи молекулярной онкологии, том 10 №4 Приложение, МАТЕРИАЛЫ VIII Всероссийской конференции по молекулярной онкологии, МАТЕРИАЛЫ VIII Всероссийской конференции по молекулярной онкологии, 20–22 декабря 2023 г., Москва, cc. 98-99 (год публикации - 2023)

14. Штам Т.А., Никитина А.В., Сорокин И.И., Пичкур Е.Б., Гараева Л.А., Коневега А.Л., Дмитриев С.Е. Растительный противоопухолевый препарат айлантон связывается с рибосомой и ингибирует биосинтез белка Успехи молекулярной онкологии, том 10 №4 Приложение, МАТЕРИАЛЫ VIII Всероссийской конференции по молекулярной онкологии, МАТЕРИАЛЫ VIII Всероссийской конференции по молекулярной онкологии 20–22 декабря 2023 г., Москва, c. 148 (год публикации - 2023)

15. Луиза Гараева, Елена Комарова, Светлана Емельянова, Елена Путевич, Андрей Л. Коневега, Борис Маргулис, Ирина Гужова, Татьяна Штам Grapefruit-Derived Vesicles Loaded with Recombinant HSP70 Activate Antitumor Immunity in Colon Cancer In Vitro and In Vivo Biomedicines, 12(12):2759 (год публикации - 2024)
10.3390/biomedicines12122759

16. Копытова А.Э., Изюмченко А.Д., Кулабухова Д.Г., Гараева Л.А., Милюхина И.В., Пичкур Е.Б., Пчелина С.Н., Штам Т.А. Криоэлектронная микроскопия экстраклеточных везикул плазмы крови при наследственных формах болезни Паркинсона XXIII Зимняя молодежная школа по биофизике и молекулярной биологии - Сборник тезисов, Гатчина, 2024, Сборник тезисов: XXIII Зимняя молодежная школа по биофизике и молекулярной биологии. Гатчина, 2024. С. 93-94. (год публикации - 2024)

17. Путевич Е.Д., Гараева Л.А., Толстыко Е.А., Спицына А.С., Соломина Л.А., Сизова И.С., Емельянова С.С., Комарова Е.Ю., Коневега А.Л., Штам Т.А. ЭКСТРАКЛЕТОЧНЫЕ ВЕЗИКУЛЫ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ КАК ДОСТАВЩИКИ ЭКЗОГЕННОГО БЕЛКА Тезисы докладов Молодежной конференции. XXIII Зимняя молодежная школа по биофизике и молекулярной биологии. Гатчина, 2024 , Сборник тезисов: XXIII Зимняя молодежная школа по биофизике и молекулярной биологии. Гатчина, 2024. С. 161-162. (год публикации - 2024)

18. Гараева Л.А., Комарова Е.Ю., Емельянова С.С., Никитина А.В., Гужова И.В., Маргулис Б.А., Коневега А.Л., Штам Т.А. ВЕЗИКУЛЫ ГРЕЙПФРУТА, НАГРУЖЕННЫЕ ЭКЗОГЕННЫМ HSP70, АКТИВИРУЮТ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЙ ИММУНИТЕТ IN VIVO Тезисы докладов Молодежной конференции. XXIII Зимняя молодежная школа по биофизике и молекулярной биологии. Гатчина, 2024, Сборник тезисов: XXIII Зимняя молодежная школа по биофизике и молекулярной биологии. Гатчина, 2024. с. 32-33 (год публикации - 2024)

19. Киль Ю.В., Пичкур Е.Б., Сергеев В.Р., Забродская Я.А., Мясников А.Г., Коневега А.Л., Штам Т.А., Самыгина В.Р., Рычков Г.Н. The archaeal highly thermostable GH35 family β-galactosidase DaβGal has a unique seven domain protein fold FEBS Journal, FEBS Journal 291 (2024) 3686–3705 (год публикации - 2024)
10.1111/febs.17166

20. Штам Т. А., Никитина А. В. , Сорокин И. И. , Пичкур Е. Б. , Гараева Л. А., Коневега А. Л., Дмитриев С. Е. Растительный препарат айлантон снижает пролиферацию опухолевых клеток, ингибируя биосинтез белка Международный Конгресс "VIII Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященный 300-летию российской науки и высшей школы" - Сборник тезисов. Саратов, 2024. , Сборник тезисов: Международный Конгресс "VIII Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященный 300-летию российской науки и высшей школы". Саратов, 2024. С. 402. (год публикации - 2024)

21. Усенко Т.С., Копытова А.Э., Изюмченко А.Д., Кулабухова Д.Г., Силантьев А.С., Казакова В.Д., Башарова К.С., Безрукова А.И., Гараева Л.А., Пичкур Е.Б., Артынюк А.В., Милюхина И.В., Тимофеева А.А., Мирошникова В.В., Нарыжный С.Н., Емельянов А.К., Захаржевская Н.Б., Коневега А.Л., Штам Т.А., Пчелина С.Н. p.N370S GBA1 Mutation Influences the Morphology and Lipid Composition of Extracellular Vesicles in Blood Plasma from Patients with Parkinson's Disease. INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES, Int J Mol Sci. 2025;26(18):9152 (год публикации - 2025)
10.3390/ijms26189152

22. Копытова А.Э., Усенко Т.С., Силантьев А.С., Лузанова В.Д., Изюмченко А.Д., Кулабухова Д.Г., Гараева Л.А., Безруких В.А., Пичкур Е.Б., Захаржевская Н.Б., Штам Т.А., Пчелина С.Н. Изменение липидомного профиля и морфологии внеклеточных везикул плазмы крови при лизосомных болезнях накопления. Объединенный научный форум VIII съезд физиологов СНГ, XV съезд аллергологов и иммунологов СНГ, симпозиум «белки и пептиды», Сочи, 23–28 апреля 2025 года. – Москва: Издательство «Медицина–Здоровье», 2025. – 105 с., Объединенный научный форум. VIII Съезд физиологов СНГ. XV Съезд аллергологов и иммунологов СНГ. Симпозиум «Белки и пептиды» (Сочи, 23–28 апреля 2025): научные труды. С. 45. (год публикации - 2025)

23. Штам Т.А., Гараева Л.А., Толстыко Е.А., Путевич Е.Д., Комарова Е.Ю., Емельянова С.С., Коневега А.Л. Внеклеточные везикулы микроводорослей для доставки экзогенных и эндогенных терапевтических белков. Материалы X Юбилейной Всероссийской конференции по молекулярной онкологии, 29-31 октября 2025 г., Москва, Успехи молекулярной онкологии. – 2025. – Т. 12, № S4. – С. 97. (год публикации - 2025)

24. Копытова А.Э., Изюмченко А.Д., Гараева Л.А., Артынюк А.В., Безруких В.А., Пичкур Е.Б., Коневега А.Л., Штам Т.А., Пчелина С.Н. Крио-электронная микроскопия внеклеточных везикул плазмы крови при лизосомных болезнях накопления. Медицинская генетика, Медицинская генетика, 2025, 24(6):72-74 (год публикации - 2025)
10.25557/2073-7998.2025.06.72-74

25. Гараева Л.А., Пичкур Е.Б., Путевич Е.Д., Спицына А.С., Соломина Л.А., Емельянова С.С., Коневега А.Л., Штам Т.А. Исследование морфологии везикул растительного и грибного происхождения с помощью криоэлектронной микроскопии. Российские нанотехнологии (принята к печати), Российские нанотехнологии (принята к печати) (год публикации - 2025)

26. Гараева Л.А., Комарова Е.Ю., Емельянова С.С., Гужова И.В., Маргулис Б.А., Коневега А.Л., Штам Т.А. Рекомбинантный Hsp70, инкапсулированный в растительные везикулы, как новый подход в иммунотерапии меланомы. Материалы X Юбилейной Всероссийской конференции по молекулярной онкологии, 29-31 октября 2025 г., Москва, Успехи молекулярной онкологии. – 2025. – Т. 12, № S4. – С. 68-69. (год публикации - 2025)

27. Гараева Л.А., Комарова Е.Ю., Емельянова С.С., Гужова И.В., Маргулис Б.А., Коневега А.Л., Штам Т.А. Новая стратегия иммунотерапии опухолей: доставка рекомбинантного HSP70 с помощью везикул растительного происхождения. Материалы научно-практических конференций в рамках 11-го Российского конгресса лабораторной медицины 2025 года. Сборник тезисов. - М.: Издательство "У Никитских ворот", 2025. - 194 с., XI Российский Конгресс лабораторной медицины / г. Москва, 1 – 3 октября 2025 год. – С. 44 (год публикации - 2025)

28. Гараева Л.А., Толстыко Е.А., Путевич Е.Д., Киль Ю.В., Спицына А.С., Емельянова С.С., Соляник А.М., Ястремский Е.В., Гармай Ю.П., Комарова Е.Ю., Варфоломеева Е.Ю., Ершов А.О., Сизова И.А., Пичкур Е.Б., Винников И.А., Кванчиани В.В., Марфина А.К., Коневега А.Л., Штам Т.А. Microalgae-Derived Vesicles: Natural Nanocarriers of Exogenous and Endogenous Proteins. Plants, Plants, 2025, 14(15), 2354 (год публикации - 2025)
10.3390/plants14152354

29. Штам Т.А., Гараева Л.А., Комарова Е.Ю., Емельянова С.С., Путевич Е.Д., Коневега А.Л., Маргулис Б.А., Гужова И.В. Активация противоопухолевого иммунитета на основе шаперона Hsp70, введенного в состав растительных везикул. МАТЕРИАЛЫ IX Всероссийской конференции по молекулярной онкологии 18–20 декабря 2024 г., Москва, Успехи молекулярной онкологии. – 2024. – Т. 11, № S4. – С. 143. (год публикации - 2024)

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Растительные везикулы - наноразмерные частицы, все чаще рассматривают в качестве доставщиков терапевтических биомолекул, в том числе и для лечения опухолевых заболеваний. Одним из перспективных методов терапии злокачественных новообразований является активация противоопухолевого иммунитета на основе шаперона HSP70, который при доставке в опухолевые клетки способен спровоцировать активацию врожденного и адаптивного иммунного ответа. Эффективная доставка HSP70 к опухолевым клеткам потенциально могла бы быть осуществлена при помощи растительных везикул. Ранее мы обнаружили, что внеклеточные везикулы, полученные из грейпфрута (GEV), способны доставлять белок в клетки человека без потери его основной функции - активности шаперона. В этом исследовании мы проверили, может ли HSP70, нагруженный в GEV (GEV-HSP70), вызывать противоопухолевый иммунный ответ в клеточных и животных моделях колоректального рака. Для проверки гипотезы in vitro использовались линии клеток колоректального рака человека и мыши. Мы показали, что добавление HSP70, как в свободной форме, так и в составе GEV, повышает чувствительность человеческих (HCT-116, DLD1) или мышиных (CT-26) клеток рака толстой кишки к мышиным цитотоксическим лимфоцитам и человеческим NK-92 клеткам. Более того, количество белка в форме GEV-HSP70, необходимое для того, чтобы вызвать такую же активацию противоопухолевого иммунитета, было в 20 раз меньше, чем при добавлении HSP70 в свободной форме. В модели карциномы толстой кишки in vivo GEV-HSP70 были подкожно введены мышам BALB/c вместе с клетками CT-26 для формирования опухолевого узла. По сравнению с контрольными группами мы наблюдали увеличение продолжительности жизни животных и уменьшение размера опухоли, а также снижение уровня факторов TGFB1 IL-10 в плазме крови. Анализ иммуномодулирующей активности GEV-HSP70 in vitro показал, что противоопухолевый ответ у мышей, обработанных GEV-HSP70, был связан с накоплением клеток CD8+. Эти результаты демонстрируют высокую эффективность новой методики на основе HSP70, инкапсулированного в растительные везикулы, в активации специфического ответа на опухоли толстой кишки. Результаты исследований опубликованы: Garaeva, et al. “Grapefruit-Derived Vesicles Loaded with Recombinant HSP70 Activate Antitumor Immunity in Colon Cancer In Vitro and In Vivo” Biomedicines 2024, 12, 2759. doi:10.3390/biomedicines12122759 В рамках выполнения проекта, поддержанного РНФ, было проведено комплексное структурно-функциональное исследование новой термостабильной бета-галактозидазы DaβGal из гипертермофильной археи Desulfurococcus amylolyticus. Фермент принадлежит к семейству гликозид-гидролаз GH35 и обладает уникальной пространственной структурой, не имеющей аналогов среди известных ферментов данного семейства. Наиболее значимым результатом проекта стало определение необычной трёхмерной структуры DaβGal с помощью комплементарных методов криоэлектронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа. Впервые установлено, что, в отличие от грибных бета-галактозидаз, являющихся мономерными белками с шестью доменами, архейный фермент DaβGal представляет собой гомодимер, состоящий из субъединиц с семью структурными доменами. Особенностью пространственной организации фермента является наличие дополнительного домена D7 с укладкой типа "рулет" (jelly roll), а также трёх составных доменов (D4, D5 и D6), формируемых удаленными участками полипептидной цепи. Такая уникальная архитектура белковой глобулы не была ранее описана для ферментов семейства GH35. Проведенный биохимический анализ показал высокую субстратную специфичность DaβGal по отношению к β-D-галактопиранозидам. Важной особенностью фермента является способность расщеплять синтетический субстрат пара-нитрофенил-β-D-фукопиранозид — редкое свойство для ферментов этого класса. DaβGal эффективно катализирует гидролиз лактозы при высоких температурах, сохраняя стабильность и активность при 65°C. При температуре 95°C время полуинактивации фермента составляет 73 минуты, что свидетельствует о его исключительной термостабильности. Полученные результаты имеют высокую научную значимость и открывают новые перспективы практического применения архейной бета-галактозидазы в биотехнологии. По сравнению с широко используемыми грибными ферментами, DaβGal обладает существенными преимуществами благодаря высокой термостабильности и эффективности катализа при повышенных температурах. Значимость проведенного исследования подтверждается публикацией статьи в престижном международном журнале FEBS Journal. Аллегорическая иллюстрация пространственной структуры DaβGal (https://doi.org/10.1111/febs.16851) была удостоена чести быть размещённой на обложке августовского номера журнала за 2024 год, что является признанием важности полученных результатов международным научным сообществом и подтверждением высокого научного уровня наших исследований. Kil, et al. “The archaeal highly thermostable GH35 family β-galactosidase DaβGal has a unique seven domain protein fold” The FEBS Journal 291 (2024) 3686–3705. doi:10.1111/febs.17166

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В рамках выполнения проекта, поддержанного РНФ, было проведено комплексное структурно-функциональное исследование на основе данных криоэлектронной микроскопии (Крио-ЭМ) эктраклеточных везикул грибов (ГЭВ) и съедобных растений (РЭВ), ранее не описанных в научной литературе. В ходе работы были впервые визуализированы в нативном состоянии везикулы крыжовника, красной смородины, брусники, ирги, калины, а также представителей царства грибов – лисичек и мухомора, представлен комплексный анализ физических параметров РЭВ и ГЭВ на основе полученных микрофотографий. Было показано, что растительные везикулы различных продуцентов, а также везикулы грибов имеют липидный бислой, преимущественно сферическую форму, единично встречаются частицы овальной формы, везикулы с повешенной электронной плотностью, мультивезикулярные мешки и РЭВ/ГЭВ, имеющие несколько билипидных слоев. В рамках биотехнологии и биомедицины одноклеточные водоросли могли бы стать одними из самых перспективных продуцентов везикул, в силу возможности стандартизации протоколов их культивирования, в том числе на биореакторах, что может обеспечить достаточный, экономичный и всесезонный удельный выход везикул в производственных масштабах. Поэтому отдельное внимание было уделено анализу везикул микроводорослей. В ходе исследования была оценена возможность использования везикул микроводорослей Chlamydomonas reinhardtii (Сhlamy-EVs) и Parachlorella kessleri (Chlore-EVs) в системах доставки экзогенных белков. Было показано отсутствие цитотоксического эффекта Сhlamy-EVs и Chlore-EVs на клеточные линии нормальной морфологии, продемонстрирована эффективная пенетрация везикул в опухолевые клетки и клетки нормальной морфологии in vitro, показана эффективная доставка экзогенного белка в клетки при помощи Сhlamy-EVs и Chlore-EVs. Более того, для Chlore-EVs и Сhlamy-EVs в результате оценки биораспределения in vivo была показана достаточная стабильность в организме, позволяющая обеспечить их эффективное накопление в органах и тканях при использовании в качестве платформы для доставки терапевтических биомолекул. Более того, в ходе выполнения работ по проекту было показано, что условия культивирования C. reinhardtii и P. kessleri влияют на удельный выход и размер секретируемых везикул. Так, воздействие тепловым шоком на C. reinhardtii и P. kessleri увеличивало концентрацию везикул в культуральной среде минимум в 3 раза, а для C. reinhardtii было показано и увеличение размера получаемых везикул. При анализе протеома с везикул C. reinhardti и P. kessleri были вычленены белки, которые у растений связаны с ответом на стресс и защитой от патогенов, а также потенциальные природные белки-антиоксиданты. Результаты работ нашли отражение в публикациях: Л.А. Гараева и др. Исследование морфологии везикул растительного и грибного происхождения с помощью криоэлектронной микроскопии // Российские нанотехнологии – принята в печать; Garaeva L., Tolstyko E. et al. Microalgae-derived vesicles: natural nanocarriers of exogenous and endogenous proteins // Plants. – 2025. – V.14(15). – P. 2354. В рамках проекта по направлению «Экстраклеточные везикулы - экзосомы человека» за отчетный методом крио-ЭМ охарактеризованы морфология и размер экстраклеточных везикул (ЭВ) плазмы крови пациентов с различными орфанными заболеваниями, связанными с нарушением функции лизосом. За отчетный период в исследовании были включены пациенты с болезнью Гоше (БГ), принимающие как ферментозаместительную, так и субстрат редуцирующую терапию, а также пациент с болезнью Ниманна-Пика типа В (БНП-В). Проведен сравнительных анализ количества, морфологии и размера ЭВ плазмы крови пациентов исследуемых групп. Выявлены изменения в морфологии и размере ЭВ плазмы крови у пациентов с лизосомными болезнями накопления (ЛБН) по сравнению с контролем. Интересным результатом стало обнаружение у пациентов с ЛБН увеличения представленности везикул с электронно-плотным грузом в их просвете, что указывало на наличие внутри них липидных или белковых комплексов. Это свидетельствует о дисбалансе обменных процессов, приводящем к накоплению внутри везикул веществ, которые, вероятно, связаны с патологическими липидными скоплениями, характерными для данных заболеваний. Необходимы дальнейшие исследования для изучения состава ЭВ при различных лизосомных болезнях накопления. Результаты проведенных исследований представлены в публикации: Копытова А.Э., и соавт. Крио-электронная микроскопия внеклеточных везикул плазмы крови при лизосомных болезнях накопления. Медицинская генетика. 2025. 24 (6). Стр. 72-74.

Публикации