Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Для реализации запланированных исследований разработаны новые биоинформационные подходы и алгоритмы для анализа результатов клеточных и молекулярно-биологических исследований. Разработаны и реализованы математические методы и инструменты анализа на основе современных вычислительных технологий, включая технологии Больших данных. Созданы мыши с транкированным Т-кадгерином (Cdh13ΔExon3), у которых в гене CDH13 отсутствует экзон 3. Поиск аналогичной изоформы Т-кадгерина человека в базах данных NCBI, ортологичной транкированной изоформе мыши (Cdh13ΔExon3), обнаружил отсутствие 3 экзона в изоформе 4 человека. Проведено сравнение двух геномов на основе выравнивания по сборке на платформе NCBI с помощью инструмента Comparative Genome Viewer. Для последующего построения филогенетического дерева Т-кадгерина человека и мыши были выровнены аминокислотные последовательности 3 экзона и последовательности мРНК гена CDH13 человека и мыши. Используя метод Bayesian inference построено филогенетическое дерево. Изучение эволюционных расстояний подтвердило наличие отдельных кластеров, каждый из которых имеет свои уникальные характеристики и варьирующие уровни сходства. Изоформа NP_062681.2 (изоформа без экзона 3 у мышей (Cdh13ΔExon3) и изоформа 4 у человека) представляет интерес для дальнейших исследований, так как показывает как их близость, так и различия, как в пределах одного вида, так и между видами. Доменный и сигнальный анализ (идентификация и классификации белковых доменов, семейств и функциональных сайтов аминокислотных последовательностей) выявил наличие прокадгеринового домена в полноразмерной форме Т-кадгерина, и его отсутствие в транкированной форме (Cdh13ΔExon3). Именно продомен значительно усиливает аффинность связывании Т-кадгерина с его лигандами ЛНП) и адипонектином (doi: 10.1172/JCI129193; doi: 10.1074/jbc.M117.780734), что позволило предсказать различное сродство к лигандам у полноразмерной и транкированной форм Т-кадгерина. Показано, что для экспрессии изоформы Т-кадгерина с вырезанным 3 экзоном существует дополнительный механизм трансляции с пропуском конвенционного стартового кодона Т-кадгерина и альтернативной инициацией трансляции. В проведенном исследовании мы подтвердили теоретически предсказанную биоинформатикой реальную экспрессию укороченной изоформы Т-кадгерина с удаленным 3 экзоном у мышей Cdh13∆Exon3. Существование изоформ Т-кадгерина было подтверждено молекулярно-биологическими, биохимическими и цитологическими методами в клетках мыши и человека, в линейных клетках млекопитающих. Эти данные получены нами впервые. Продолжено создание коллекции образцов МСК, добавилось 15 новых образцов. Выполнен транскриптомный анализ (scRNAseq) МСК, выделенных из подкожной жировой ткани человека (2 доноров) до и после индукции дифференцировки в адипогенном направлении. Проведен широкомасштабный биоинформатический анализ данных секвенирования. Обнаружено, что клетки с высоким уровнем CDH13 (Т-кадгерина) локализуются в одном кластере, преимущественно в контрольном недифференцированном образце, где клетки также экспрессируют маркеры стволовых/прогениторных клеток жировой ткани DPP4, Notch1, рецептор Notch3, NANOG, SPN, SOX2, PRMT8 ключевые маркеры МСК (CD90, PDGFR), белки семейства Wnt, LDLR, фактор регуляции адипогенеза, N-кадгерин, нейропилин 2, IGFBP4 и гены, участвующие в биогенезе экзосом (CD9, CD63, CAV1) (всего 485 генов). Построение сплит-violin графиков подтвердило, что самая высокая экспрессия CDH13 наблюдается в кластере 3 контрольного образца, для которого также характерна экспрессия основного маркера ранних прогениторных клеток, обеспечивающих обновление адипоцитов жировой ткани, - гена DPP4 (10.1126/science.aav2501). При адипогенной индукции экспрессия мРНК Т-кадгерина снижалась почти в 5 раз по сравнению с контролем. Проведено генное профилирование и анализ траектории развития МСК человека с использованием псевдовременных траекторий на основе scRNA-seq данных. На основе сгенерированного дерева транскрипционных состояний мы определили возможный сценарий, по которому клетки, экспрессирующие Т-кадгерин, занимают особое положение среди других кластеров и не участвуют в адипогенной дифференцировке, а скорее всего представляют собой отдельную субпопуляцию стволовых/прогениторных клеток с регуляторными свойствами. Получены данные ко-иммунопреципитации, подтверждающие то, что Т-кадгерин может формировать комплексы с AdipoR1, AdipoR2 и LDLR, а добавление лигандов (адипонектина и ЛНП) разобщает эти латеральные взаимодействия. Cозданы лентивирусные конструкции для гиперэкспрессии Т-кадгерина (LV-LeGO-hTcad-IRES-eGFP) наряду с контрольным вирусом (LV-LeGO-eGFP); оба конструкта содержали GFP. Анализ адгезии и пролиферации показал снижение пролиферативного потенциала МСК при гиперэкспрессии Т-кадгерина. МСК, гиперэкспрессирующие Т-кадгерин, сохраняют недифференцированное состояние и не участвуют в накоплении липидных капель в процессе адипогенеза, что было подтверждено прижизненным наблюдением за судьбой индивидуальных клеток в течение 10 дней в сочетании с окрашиванием Nile Red. Получены данные о влиянии экспрессии Т-кадгерина на экспонирование инсулинового рецептора (IR) на мембране МСК. Т-кадгерин экспрессируется в субпопуляции МСК, не несущей на поверхности IR. Подавление экспрессии Т-кадгерина увеличивает долю IR клеток с 2% до 10%. Анализ способности МСК, выделенных из жировой ткани Cdh13∆Exon3 мышей, к адипогенной дифференцировке показал их склонность к спонтанной дифференцировке по сравнению с МСК из контрольных мышей C57Bl6. При индукции коктейлем факторов, содержащим инсулин, МСК из Cdh13∆Exon3 мышей более активно накапливали липидные капли. Трансдукция МСК из Cdh13∆Exon3 мышей лентивирусной конструкцией для гиперэкспрессии Т-кадгерина приводила к практически полному подавлению адипогенной дифференцировки. Данные получены при окрашивании Nile Red и Oil Red O, в сочетании с анализом флуоресцентной и фазово-контрастной микроскопией, а также при анализе содержания Oil Red O в элюатах с использованием спектрофотометрии. Для автоматического подсчета соотношения дифференцированных адипоцитов к общему числу клеток нами был создан алгоритм с использованием методов искусственного интеллекта и глубокого машинного обучения. Анализ экспрессии ранних (PPARγ, C/EBPβ) и поздних маркеров (адипонектин (AdipoQ), leptin, perilipin) адипогенной дифференцировки методами Western blotting и ELISA показал, значительное увеличение экспрессии поздних маркеров адипогенеза, что свидетельствует о том, что в отсутствии Т-кадгерина МСК становятся коммитированными адипоцитами и спонтанно дифференцируются в адипоцитарном направлении. Т-кадгерин является важнейшим фактором, удерживающим МСК в недифференцированном стволовом состоянии.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Проведены широкомасштабные исследования механизмов адипогенной дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и роли T-кадгерина/CDH13 в этой регуляции. Разработаны биоинформационные подходы и алгоритмы для анализа результатов клеточных и молекулярно-биологических исследований, реализованы математические методы и инструменты анализа на основе современных вычислительных технологий, включая технологии Больших данных. Проведенный биоинформационный анализ экспрессии CDH13 в норме и при инсулинорезистентности на основе scRNA-seq МСК человека показал транзиентный характер экспрессии CDH13/T-кадгерина при индукции адипогенеза. Установлено, что высокий уровень CDH13 характерен для стволовых/ранних прогениторных клеток в составе гетерогенной популяции МСК в норме. В недифференцированных клетках высокий уровень CDH13 поддерживается транскрипционными факторами GATA6 (основной регулятор), ATF4, ZEB1, HDAC2, CREB3L1, ARID5B. При индукции адипогенеза происходит переключение регуляторной программы и динамичное снижение CDH13. Согласно SCENIC-анализу, в дифференцирующихся клетках в норме единственным доминирующим регулятором CDH13 становится THRB, для которого известна роль этого фактора как лиганд-зависимого регулятора метаболизма. При инсулинорезистентности регуляция экспрессии CDH13 нарушается. По данным SCENIC-анализа, вместо доминирования репрессора THRB формируется патологическая транскрипционная сеть, включающая триаду активаторов FOXO1-KLF4-HMGA2, Построение динамической модели адипогенеза с использованием методов псевдовремени (Slingshot, RNA velocity) позволило отследить дифференцировочные траектории МСК и выявить ключевые точки переходов. МСК здорового донора при индукции адипогенеза формируют три траектории: ускоренная, промежуточная и замедленная, каждая из которых завершается формированием зрелых адипоцитов при последовательной активации адипогенных факторов и подавлении CDH13. В МСК инсулинорезистентного донора наблюдается иная картина: доля зрелых адипоцитов снижается до 50%, часть клеток не проходит ключевые стадии дифференцировки и отклоняется по альтернативным траекториям. Таким образом, при инсулинорезистентности нарушается нормальная траектория развития адипогенеза, формируются патологические направления дифференцировки, включая стареющие, апоптотические и гладкомышечные фенотипы, что соответствует клиническим наблюдениям: нарушению адипогенеза в жировой ткани, выраженному фиброзу и хроническому воспалению, обусловленному дефицитом здоровых адипоцитов при метаболических нарушениях. Полученные с помощью биоинформационных методов данные и модели были подтверждены комплексом молекулярно-биологических, биохимических и цитологических экспериментов. Эксперименты по модификации уровня Т-кадгерина подтвердили, что этот белок является негативным регулятором адипогенеза на уровне регуляции биохимических процессов и сигнальных каскадов. Подавление экспрессии Т-кадгерина в линейных мышиных клетках 3T3-L1 приводило к активации проадипогенных сигналов. Напротив, гиперэкспрессия T-кадгерина удерживала клетки в недифференцированном состоянии и предотвращала их пролиферацию. Используя МСК человека с разным уровнем экспрессии Т-кадгерина после лентивирусной трансдукции, анализировали активацию сигнальных путей в присутствии известных лигандов Т-кадгерина (LMW – низкомолекулярный адипонектин, HMW высокомолекулярный адипонектин, ЛНП – липопротеиды низкой плотности). Полученные результаты свидетельствуют о том, что в МСК активация AMPK пути преимущественно опосредуется LMW адипонектином и не зависит от уровня экспрессии T-кадгерина. Воздействие HMW-адипонектина и ЛНП не вызывало достоверного изменения уровня фосфорилирования AMPK, в то время как LMW-адипонектин оказывал ингибирующее воздействие на mTOR. Используя алгоритмы искусственного интеллекта и машинного обучения в сочетании с морфологическими, иммунофлуоресцентными и гистологическими методами исследования подтверждено функциональное влияние T-кадгерина на дифференцировку адипоцитов. Подавление Т-кадгерина значительно увеличивает число и размер адипоцитов, содержащих липидные капли, при дифференцировке МСК, тогда как при гиперэкспрессии T-кадгерина с помощью лентивирусной конструкции дифференцировка затруднена. Особое внимание было уделено эпигенетическим механизмам и малым некодирующим РНК: выполнен поиск и функциональный анализ микроРНК, потенциально взаимодействующих с мРНК CDH13. В частности, идентифицированы две микроРНК - hsa-miR-181a и hsa-miR-31-3p - которые, согласно биоинформационному анализу, имеют CDH13 в списке предсказанных мишеней и известны своей ролью в адипогенезе (miR-31 - негативный регулятор дифференцировки за счёт подавления C/EBPα; miR-181a - позитивный регулятор - ингибирование miR-181a снижает экспрессию PPARγ и генов глюкозного метаболизма). Для количественной верификации этих микроРНК был оптимизирован метод stem-loop RT-PCR. В совокупности полученные данные свидетельствуют о центральной роли CDH13/T-кадгерина в регуляции судьбы МСК жировой ткани, процессах обновления и дифференцировки в норме и при патологии. В норме последовательное подавление экспрессии CDH13, характерное для стволовых клеток, является необходимым условием формирования зрелых адипоцитов. В условиях же инсулинорезистентности хронически высокая экспрессия CDH13/T-кадгерина приводит к нарушению дифференцировочной программы и процессов морфогенеза в жировой ткани. При инсулинорезистентности формируются патологические направления дифференцировки (гладкомышечные клетки), накапливаются сенесцентные и апоптотические клетки, что соответствует клинической картине нарушенного адипогенеза при метаболическом синдроме, ассоциированного с фиброзом и хроническим воспалением с характерным дефицитом функционально зрелых адипоцитов. T-кадгерин является интегральным регулятором траекторий адипогенной дифференцировки и перспективной мишенью для воздействий, направленных на коррекцию патологических изменений при метаболических нарушениях. Предложенные методы и подходы биоинформационных исследований ключевых биологических процессов на основе Т-кадгерина позволят получить фундаментальные знания, имеющие прикладное значение для регенеративной медицины с высоким потенциалом широкого практического применения и формирования новых научных направлений. В дальнейшем будут предложены методики практического применения методов оценки и модуляции уровня Т-кадгерина в регенеративной медицине для коррекции метаболических нарушений, в частности ожирения и сопутствующих заболеваний.